H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体及应用，其中单克隆抗体为IgG1、κ型，单克隆抗体包括重链可变区氨基酸及轻链可变区氨基酸，重链可变区氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示的HCDR1、SEQ ID No.6所示的HCDR2、SEQ ID No.7所示的HCDR3；轻链可变区氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示的LCDR1、SEQ ID No.9所示的LCDR2、SEQ ID No.10所示的LCDR3。LCDR3。LCDR3。

【技术实现步骤摘要】
H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体及应用


[0001]本专利技术涉及一种H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体及应用，属于生物技术


技术介绍

[0002]流感病毒属于正粘病毒科，可分为A、B、C、D四型，其中A型流感病毒宿主范围最广，是引起流感大流行的主要类型。根据病毒囊膜表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性不同，A型流感病毒可分为18个HA亚型和11个NA亚型。
[0003]H7N9亚型禽流感病毒（AIV）能够跨越宿主屏障感染人类，引起发病甚至死亡，其中感染病人的死亡率高达约40%。疫苗接种是预防流感病毒感染的最有效有段，但是现有技术中仍没有人用的H7N9亚型禽流感疫苗。临床上，主要采用抗病毒药物，如奥司他韦和金刚烷胺等，进行流感病毒感染的治疗。抗病毒药物的最大问题是病毒的耐药性，临床研究发现：流感病毒在药物暴露期间会出现耐药性突变，导致对奥司他韦出现耐药。此外，抗流感病毒药物必须在症状出现后48小时内用药，治疗时间窗较短，限制了药物的治疗效果。基于H7N9亚型AIV对公共卫生的潜在威胁，研制H7N9亚型禽流感的新型防治药物迫在眉睫。单克隆抗体具有高度的特异性和良好的安全性，在癌症、自身免疫性疾病和重大传染病的治疗方面得到了广泛应用，取得了良好的效果。一些单克隆抗体药物已被批准用于预防和治疗多种传染病，例如预防呼吸道合胞病毒感染的Palivizumab和防治埃博拉病毒感染的Ansuvimab。
[0004]单克隆抗体的接种途径对其保护效力具有重要影响。现有的单克隆抗体药物大多数经过静脉注射途径进行给药，可保证药物的全身性分布和较高的血药浓度。但是，静脉接种途径却难以将药物递送至呼吸道等部位。H7N9亚型AIV主要在人的呼吸系统，包括气管与肺，中复制，导致急性上呼吸道感染和肺炎。单克隆抗体药物经静脉接种，在呼吸道与肺脏中的药物浓度低，对H7N9亚型AIV的抑制效率低。为保证抗体对呼吸系统中病毒的有效抑制，单克隆抗体经静脉途径接种往往需要增大剂量，增加治疗成本。为解决单克隆抗体向呼吸系统靶向递送的问题，研究者利用基因工程技术将抗体转变为适合鼻腔接种的类型，如纳米抗体、IgM，或利用可在呼吸道复制的病毒为载体递送抗体分子。但是，基因工程技术表达的重组抗体产量较低，且病毒载体技术需要复杂的分子生物学与病毒学技术，不利于工业化制备。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有
技术介绍
中的不足，提供一种H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体，应用于鼻内接种，提高对H7N9亚型禽流感病毒的抵抗效力。
[0006]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：本专利技术提供一种H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体，所述单克隆抗体为IgG1、κ型，所述单克隆抗体包括重链可变区氨基酸及轻链可变区氨基酸。
[0007]所述重链可变区氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示的HCDR1、SEQ ID No.6所示的HCDR2、SEQ ID No.7所示的HCDR3；所述轻链可变区氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示的LCDR1、SEQ ID No.9所示的LCDR2、SEQ ID No.10所示的LCDR3。
[0008]进一步的，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0009]进一步的，所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，能够利用常规基因工程或蛋白质工程的方法表达抗体，避免了杂交瘤细胞长期冻存抗体基因的丢失，同时有利于在基因和蛋白水平上进行抗体优化，提高抗体的特异性和亲和力。
[0010]本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体含有上述所述的重链可变区核苷酸序列及轻链可变区的核苷酸序列。
[0011]本专利技术还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述所述的表达载体。
[0012]进一步的，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌产生。
[0013]进一步的，所述单克隆抗体能够与H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的抗原表位特异性结合，所述抗原表位为血凝素蛋白第151位甘氨酸，与不同H7亚型HA蛋白具有交叉反应性。
[0014]进一步的，所述单克隆抗对H7N9病毒具有血凝抑制与病毒中和活性，应用在鼻内接种药物的制备，显著提高保护效力。
[0015]进一步的，所述单克隆抗在制备H7N9亚型禽流感病毒检测产品中的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果：本专利技术提供的一种H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体，对H7N9病毒具有血凝抑制与病毒中和活性，应用在鼻内接种，有效提高保护效力，为研制喷鼻抗体制剂提供参考；本专利技术提供的抗体识别HA蛋白Antigenic Site A的高度保守的G151位点，与不同H7亚型HA蛋白具有交叉反应性，为研制广谱性抗体药物提供有利信息；基于本专利技术提供的单克隆抗体基因序列，可以利用常规基因工程或蛋白质工程的方法表达抗体，避免了杂交瘤细胞长期冻存抗体基因的丢失，同时有利于在基因和蛋白水平上进行抗体优化，提高抗体的特异性和亲和力；本专利技术提供的单克隆抗体能够特异性识别H7亚型禽流感病毒血凝素蛋白保守的抗原表位，且具有较强的病毒中和活性，为探究H7亚型禽流感病毒的免疫学特性及病毒治疗制剂的研制提供了新的生物材料。
附图说明
[0017]图1 为本专利技术实施例提供的H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体的生物学活性鉴定图，其中图A表示抗体的HI与VN效价，图B为抗体的终点反应浓度；图2 含有单克隆抗体重链与轻链可变区基因的质粒PCR鉴定图。每个基因各挑取两个质粒进行PCR鉴定。
[0018]图3 为本专利技术实施例提供的H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体识别抗原表位的定位图，其中图A为抗体针对野生病毒与逃逸病毒的HI效价，图B为抗体识别表位G151
在HA蛋白上的空间定位；图4 为本专利技术实施例提供的H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体识别抗原表位的验证结果图；图5 为本专利技术实施例提供的H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体的交叉反应性测定图；图6 为本专利技术实施例提供的H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体经腹腔接种小鼠的预防性保护效力图，其中图A为小鼠的体重曲线；图B为小鼠在H7N9病毒感染后的生存率；图7为本专利技术实施例提供的H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体经腹腔接种小鼠的治疗性保护效力图，其中图A为攻毒前12 h使用抗体的小鼠体重曲线；图B为攻毒前12 h使用抗体的小鼠生存率；图C为攻毒前24 h使用抗体的小鼠体重曲线；图D为攻毒前24h使用抗体的小鼠生存率；图8 为本专利技术实施例提供的H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体经腹腔、鼻内接种的预防性与治疗性保护效力图，其中图A为预防性保护试验小鼠体重曲线；图B为预防性保护试验小鼠生存率；图C为治疗性保护试验（攻毒前48 h使用抗体）小鼠体重曲线；图D为治疗性保护试验（攻毒前4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG1、κ型，所述单克隆抗体包括重链可变区氨基酸及轻链可变区氨基酸，所述重链可变区氨基酸序列包括SEQ ID No.5所示的HCDR1、SEQ ID No.6所示的HCDR2、SEQ ID No.7所示的HCDR3；所述轻链可变区氨基酸序列包括SEQ ID No.8所示的LCDR1、SEQ ID No.9所示的LCDR2、SEQ ID No.10所示的LCDR3。2.根据权利要求1所述的一种H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。3.根据权利要求1所述的一种H7N9亚型禽流感病毒中和性单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。4.一种表达载体，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡增垒，胡娇，何晓政，邓婧，赵江艳，刘秀梵，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：