外泌体分离方法和分离系统技术方案

本文提供了一种分离外泌体的方法，包括1)采用死端过滤从包括所述外泌体的细胞培养上清液中除去粒径大于所述外泌体的粒径的细胞组分；以及2)采用切向流过滤对步骤1)获得的滤出液进行循环浓缩，同时除去粒径小于所述外泌体的粒径的细胞组分。本文还提供了外泌体分离系统。本文提供的外泌体分离方法和分离系统可用于外泌体大规模分离，解决了现有技术中外泌体分离操作复杂、样本量小、重复性差的问题。重复性差的问题。重复性差的问题。

【技术实现步骤摘要】
外泌体分离方法和分离系统


[0001]本文涉及分离外泌体的方法和系统，尤其是用于大规模外泌体分离的方法和工艺系统。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosomes)是活细胞分泌的，大小为30
‑
200nm，密度为1.13
‑
1.18g/ml的双层膜结构囊泡状小体。外泌体携带了多种生物活性物质(如蛋白质、脂质、miRNA等)，因此由细胞分泌的外泌体可代替细胞发挥修复治疗多种重要器官及组织损伤的功能。而且，外泌体的应用避免了细胞直接移植存在的多种潜在风险，且免疫原性低又便于保存和运输，作为“无细胞的细胞治疗技术”显示出独特的优势。因为外泌体的独特运输特性，其也被研究做为药物递送载体，如递送RNA用于基因治疗。而做为递送平台，外泌体的需求量非常大，仅在一只动物(如小鼠)身上进行实验就需要109‑
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11
个外泌体，因此大规模生产外泌体以及大规模分离外泌体是外泌体临床转化的重要的技术。
[0003]获取高纯度、高产量、标准化的外泌体，是外泌体广泛应用的前提条件。然而，针对外泌体的分离纯化方法还没有统一的标准，严重制约着外泌体相关的基础研究及临床应用。目前已有多种方法用于分离外泌体，如超速离心法、密度梯度离心法、免疫分离法及聚合沉淀法等，但都具有一定的局限性。超速离心法是最常用的方法，被视为外泌体提取的“金标准”，但需要配备昂贵的超速离心机，且操作复杂，耗时久，产量低，难以大规模地处理大体积样品；免疫分离法则只能特异性富集表达某种或某几种特异性表面蛋白质的外泌体，需要用到抗体等昂贵试剂，同样难以大规模处理大体积的样品；聚合沉淀法获得的外泌体通常会混有蛋白质和聚合物等杂质，纯度低，且外泌体的活性得不到保障，使后续分析受到一定的限制。因此，为了加速外泌体的应用，开发一种装置，用于大规模地分离纯化外泌体，具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]在一方面，本文提供了一种外泌体分离方法，其包括步骤：
[0005]1)采用死端过滤从包括所述外泌体的细胞培养上清液中除去粒径大于所述外泌体的粒径的细胞组分；以及
[0006]2)采用切向流过滤对步骤1)获得的滤出液进行循环浓缩，同时除去粒径小于所述外泌体的粒径的细胞组分。
[0007]在一些实施方案中，步骤1)采用串联连接的两个或更多个死端过滤器进行所述死端过滤。
[0008]在一些实施方案中，步骤1)中至少一个所述死端过滤器的滤孔孔径为0.22μm。
[0009]在一些实施方案中，步骤1)采用两个死端过滤器，其中一个死端过滤器的滤孔孔径为1μm，另一个死端过滤器的滤孔孔径为0.22μm。
[0010]在一些实施方案中，所述死端过滤器为囊式过滤器。
[0011]在一些实施方案中，所述切向流过滤采用中空纤维柱进行。
[0012]在一些实施方案中，所述中空纤维柱的截留分子量为100
‑
750KD，优选300
‑
500KD。
[0013]在一些实施方案中，步骤2)中切向流过滤采用3psi的剪切力进行。
[0014]在一些实施方案中，所述细胞为间充质干细胞。
[0015]在一些实施方案中，所述外泌体的平均粒径为30
‑
200nm。
[0016]另一方面，本文提供了一种外泌体分离系统，其包括：
[0017]1)第一死端过滤装置，用于从包括所述外泌体的细胞培养上清液中除去粒径大于所述外泌体的粒径的细胞组分；
[0018]2)与所述第一死端过滤装置连接的第一容器，其容纳经所述死端过滤装置过滤后的滤出液；以及
[0019]3)切向流过滤装置，用于对所述第一容器中的所述滤出液进行循环浓缩，同时除去粒径小于所述外泌体的粒径的细胞组分。
[0020]在一些实施方案中，所述第一死端过滤装置包括至少两个串联连接的死端过滤器。
[0021]在一些实施方案中，至少一个所述死端过滤器的滤孔孔径为0.22μm。
[0022]在一些实施方案中，所述切向流过滤装置包括截留分子量为100～750KD的中空纤维柱，优选300
‑
500KD。
[0023]在一些实施方案中，所述切向流过滤装置的进口和出口分别与所述第一容器的同一侧的下部连接。
[0024]在一些实施方案中，所述外泌体分离系统还包括，第一蠕动泵，用于向所述第一死端过滤装置输入包括所述外泌体的细胞培养上清液；第二蠕动泵，用于将所述第一容器中的所述滤出液输入所述切向流过滤装置。
[0025]在一些实施方案中，所述外泌体分离系统还包括与所述切向流过滤装置的透过口相连的所述第二容器，用于容纳来自所述切向流过滤装置的透出液。
[0026]在一些实施方案中，所述外泌体分离系统还包括与所述第一容器相连的第三容器，用于容纳经浓缩的、包括所述外泌体的所述滤出液。
[0027]在一些实施方案中，在所述第一容器和所述第三容器中间还包括用于进行除菌过滤的第二死端过滤装置。
[0028]在一些实施方案中，所述外泌体的平均粒径为30
‑
200nm。
[0029]本文提供的用于外泌体大规模分离的方法和工艺系统，解决了现有技术中操作复杂、样本量小、重复性差，不能用于大规模制备外泌体的问题。
附图说明
[0030]图1为本文提供的外泌体分离系统的结构示意图。
[0031]图2为本文提供的外泌体分离系统的一个具体实例的结构图。
[0032]图3为培养的细胞随时间的增殖曲线图。
[0033]图4为分离的外泌体的电镜图。(A)从实施例2Day4细胞上清分离的外泌体的电镜图；(B)实施例3分离的外泌体的电镜图；(C)实施例4分离的外泌体的电镜图；(D)实施例5分离的外泌体的电镜图；(E)实施例6分离的外泌体的电镜图；(F)实施例7超速离心所分离的
外泌体的电镜图。
[0034]图5为分离的外泌体的粒径分布示意图。(A)实施例2中不同培养天数分离的外泌体粒径分布示意图；(B)实施例3分离的外泌体粒径分布示意图；(C)实施例4分离的外泌体粒径分布示意图；(D)实施例5分离的外泌体粒径分布示意图；(E)实施例6分离的外泌体粒径分布示意图；(F)实施例7分离的外泌体粒径分布示意图。横坐标为粒径(nm)，纵坐标为浓度(颗粒数/mL)。
[0035]图6为实施例4分离的外泌体的蛋白标志物表达电泳图。
具体实施方式
[0036]除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0037]“死端过滤”，也称为“垂直过滤”或“全量过滤”，指溶剂和小于过滤孔的溶质(如小颗粒物)在压力的驱动下穿过过滤装置的过滤孔(流动方向大体上与过滤膜表面垂直)，而大于过滤孔的颗粒被截留，通常留在过滤装置中，例如堆积在过滤膜表面上。加压或者抽真空的方式可以为过滤提供所需的压力。过滤过程中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离外泌体的方法，包括步骤：1)采用死端过滤从包括所述外泌体的细胞培养上清液中除去粒径大于所述外泌体的粒径的细胞组分；以及2)采用切向流过滤对步骤1)获得的滤出液进行循环浓缩，同时除去粒径小于所述外泌体的粒径的细胞组分。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤1)采用串联连接的两个或更多个死端过滤器进行所述死端过滤。3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤1)中至少一个所述死端过滤器的滤孔孔径为0.22μm。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中步骤1)采用两个死端过滤器，其中一个死端过滤器的滤孔孔径为1μm，另一个死端过滤器的滤孔孔径为0.22μm。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中所述死端过滤器为囊式过滤器。6.如权利要求1
‑
5任一项所述的方法，其中所述切向流过滤采用中空纤维柱进行。7.如权利要求1
‑
6任一项所述的方法，其中所述中空纤维柱的截留分子量为100
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750KD，优选300
‑
500KD。8.如权利要求1
‑
7任一项所述的方法，其中步骤2)中切向流过滤采用3psi的剪切力进行。9.如权利要求1
‑
8任一项所述的方法，其中所述细胞为间充质干细胞。10.如权利要求1
‑
9任一项所述的方法，其中所述外泌体的平均粒径为30
‑
200nm。11.外泌体分离系统，包括：1)第一死端过滤装置，用于从包括所述外泌体的细胞培养上清液中除去粒径大于所述外泌体的粒径的细胞组分；2)与所述第一死端过滤装置连接的第一容器，其容纳经所述死端过滤装置过滤后的滤出液；以及3)切向流过滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，鄢晓君，张志华，张元元，
申请(专利权)人：北京华龛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：