一种抑肽酶的提取纯化方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质提取纯化技术领域，公开了一种抑肽酶的提取纯化方法，包括以下步骤：(1)将牛肺绞碎成浆后加入硫酸溶液进行提取，过滤后得到滤液；(2)在所述滤液中加入三氯乙酸，经静置沉淀、过滤、超滤浓缩，得到浓缩液；(3)将所述浓缩液上样至疏水层析柱中，经洗涤、洗脱处理后收集洗脱液；(4)将所述洗脱液上样至凝胶过滤层析柱，经冲洗后收集流出液；(5)所述流出液经超滤换盐、冻干，得到抑肽酶成品。本发明专利技术具有工艺时间短，操作简便的优点，纯化过程可以使抑肽酶理化性质和生物活性保持稳定，最终使抑肽酶的各项指标均符合中国药典标准，本发明专利技术得到的抑肽酶效价达到6000KIU/mg以上，产品收率达85％以上。产品收率达85％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种抑肽酶的提取纯化方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质提取纯化
，特别是涉及一种抑肽酶的提取纯化方法。

技术介绍

[0002]抑肽酶(Aprotinin)是一种碱性多肽，分子量6500，由58个氨基酸残基组成，它的分子内有3对双硫键，其中一对双硫键(14
‑
38)位于分子表面，它使两段肽链(32
‑
42，9
‑
21)连接在一起，这一对双硫键被还原和重新氧化后不影响抑制剂活力，另外两对双硫键(5
‑
55，30
‑
51)位于分子内部，一旦还原后即失活，整个分子呈梨形，长29A，中部圆形部位直径19A，其活性中心为赖氨酸，位于分子的顶端。抑肽酶为非特异性蛋白酶抑制剂，能抑制多种含有丝氨酸活性基因的蛋白酶，主要抑制纤溶酶；抑肽酶能抑制中性白细胞激活和脱颗粒，减少补体激活，具有抗炎作用：因纤溶酶对血小板数量和功能有破坏作用，抑肽酶对血小板也有保护作用，在临床上已广泛的应用于治疗急性胰腺炎、喘息性支气管炎、烧伤性休克及癌症手术、脑外科、骨科、预防肠粘连、治疗急性胃黏膜出血、剖宫产术、鼻内窥镜术、产后大出血和心肺转流(CPB)心脏等手术中：在体外循环心脏直观手术中，可以减少出血和输血量，可以保护肺损伤和心肌，减少体外循环心脏直观手术所导致的机体炎症反应。
[0003]抑肽酶的传统制备方法为结晶法，结晶法是先将肺脏进行酸提取，提取液进行分段盐析，再经亲和层析制成抑肽酶成品，此种方法缺点是硫酸铵耗量大，生产周期长，成本高。/>[0004]文献《化学改性与修饰壳聚糖固定化酶制备高比活抑肽酶新工艺》中将化学改性与修饰壳聚糖公家欧联配基牛胰蛋白酶，制成固定化酶为抑肽酶亲和吸附剂，直接对黄牛肺提取液层析纯化，在超滤脱盐，浓缩，去热原得到抑肽酶，酶活性收率55％，此工艺合成的亲和吸附剂机械强度小，批间质量差异大，抗污染能力差，固定的胰蛋白酶易脱落，难以实现工业化生产。
[0005]由此可见，如何提供一种工艺时间短、操作简便、成本低、纯化效果好，且适于工业化放大生产的抑肽酶的提取纯化方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种抑肽酶的提取纯化方法，以解决现有抑肽酶纯化方法周期长、成本高、纯化效果差的技术问题。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种抑肽酶的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0009](1)将牛肺绞碎成浆后加入硫酸溶液进行提取，过滤后得到滤液；
[0010](2)在所述滤液中加入三氯乙酸，经静置沉淀、过滤、超滤浓缩，得到浓缩液；
[0011](3)将所述浓缩液上样至疏水层析柱中，经洗涤、洗脱处理后收集洗脱液；
[0012](4)将所述洗脱液上样至凝胶过滤层析柱，经冲洗后收集流出液；
[0013](5)所述流出液经超滤换盐、冻干，得到抑肽酶成品。
[0014]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(1)中所述硫酸溶液浓度为0.1
‑
0.2mol/L，且所述硫酸添加量与所述牛肺的比例为(0.5
‑
3)L：1kg；
[0015]进一步优选的，所述硫酸溶液浓度为0.16mol/L，且所述硫酸添加量与所述牛肺的比例为1.2L：1kg，即每千克牛肺中添加1.2L硫酸溶液。
[0016]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(1)中所述提取为搅拌提取，且所述搅拌提取时间为1
‑
5h；进一步优选的，所述搅拌提取时间为3h。
[0017]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(1)中所述提取次数为1
‑
3次，合并多次提取后的滤液。
[0018]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(2)中加入三氯乙酸至滤液饱和度为3.2％(v/v)；
[0019]和/或所述静置沉淀时间为2
‑
3h，静置环境温度为10℃以下。
[0020]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(2)中所述超滤浓缩采用的是1KD超滤膜。
[0021]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(3)中将所述浓缩液上样至疏水层析柱之前还包括：加入硫酸铵调节所述浓缩液电导率至160
‑
170ms/cm，蛋白浓度至40
‑
55mg/ml。
[0022]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(3)中所述疏水层析柱填料为Capto Phenyl High Sub；
[0023]和/或所述疏水层析柱经pH为7.6的平衡液进行平衡处理，所述平衡液为含1.4mol/L(NH4)2SO4的0.02mol/L PB溶液；
[0024]和/或所述洗涤处理中使用的是pH为7.6洗涤液，所述洗涤液为含0.8mol/L(NH4)2SO4的0.02mol/L PB溶液；
[0025]和/或所述洗脱处理中使用的是pH为7.6的洗脱液，所述洗脱液为含0.24
‑
0.28mol/L(NH4)2SO4的0.02mol/L PB溶液。
[0026]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(4)中所述凝胶过滤层析柱填料为Superdex 75prep grade；
[0027]所述凝胶过滤层析柱经pH为7.0的平衡液进行平衡处理，所述平衡液为0.2mol/L PB，且所述冲洗过程中收集含有抑肽酶的洗脱峰。
[0028]优选的，在上述抑肽酶的提取纯化方法中，步骤(5)中所述超滤换盐采用的换盐液是0.8
‑
1.5mmol/L的乙酸钠溶液；
[0029]进一步优选的，所述超滤换盐采用的换盐液是1mmol/L的乙酸钠溶液。
[0030]本专利技术提供了一种抑肽酶的提取纯化方法，与现有技术相比，其有益效果在于：
[0031]本专利技术采用硫酸溶液从牛肺中提取抑肽酶，经三氯乙酸沉淀杂蛋白后进行疏水层析和凝胶过滤层析，充分利用抑肽酶在疏水性及分子量方面与其他杂蛋白的差异特点进行纯化抑肽酶。
[0032]本专利技术工艺中采用商品化的层析介质，质量稳定，批次之间产品质量差异小，适合大规模工业化生产。
[0033]本专利技术具有工艺时间短，操作简便的优点，纯化过程可以使抑肽酶理化性质和生物活性保持稳定，最终使抑肽酶的各项指标均符合中国药典标准，本专利技术得到的抑肽酶效
价达到6000KIU/mg以上，产品收率达85％以上。
具体实施方式
[0034]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0035]实施例1
[0036](1)将10kg新鲜的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑肽酶的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将牛肺绞碎成浆后加入硫酸溶液进行提取，过滤后得到滤液；(2)在所述滤液中加入三氯乙酸，经静置沉淀、过滤、超滤浓缩，得到浓缩液；(3)将所述浓缩液上样至疏水层析柱中，经洗涤、洗脱处理后收集洗脱液；(4)将所述洗脱液上样至凝胶过滤层析柱，经冲洗后收集流出液；(5)所述流出液经超滤换盐、冻干，得到抑肽酶成品。2.根据权利要求1所述的抑肽酶的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述硫酸溶液浓度为0.1
‑
0.2mol/L，且所述硫酸添加量与所述牛肺的比例为(0.5
‑
3)L：1kg。3.根据权利要求1所述的抑肽酶的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取为搅拌提取，且所述搅拌提取时间为1
‑
5h。4.根据权利要求1所述的抑肽酶的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中加入三氯乙酸至滤液饱和度为3.2％；和/或所述静置沉淀时间为2
‑
3h，静置环境温度为10℃以下。5.根据权利要求1所述的抑肽酶的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述超滤浓缩采用的是1KD超滤膜。6.根据权利要求1所述的抑肽酶的提取纯化方法，其特征在于，步骤(3)中将所述浓缩液上样至疏水层析柱之前还包括：加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡著阳，万偲，耿卫锋，李菊根，魏超娟，夏克坚，
申请(专利权)人：江西浩然生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：