一种高效表达生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法技术

一种高效表达生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，具体步骤为：先PCR扩增半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因CST7，通过双酶切与表达载体质粒pPIC9K连接，在毕赤酵母里构建了重组基因，引入了外源基因CST7，通过诱导CST7基因表达。本发明专利技术构建的高效表达半胱氨酸蛋白酶抑制剂工程菌能够高效生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂，对表达的产物进行分离纯化后半胱氨酸蛋白酶抑制剂含量可达到80％以上。本发明专利技术应用于生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂领域。氨酸蛋白酶抑制剂领域。氨酸蛋白酶抑制剂领域。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法


[0001]本专利技术涉及一种蛋白酶抑制剂的制备方法，更具体地说，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂的生产方法。

技术介绍

[0002]半胱氨酸蛋白酶抑制剂又名巯基蛋白酶抑制剂，是指一类可逆竞争性地结合半胱氨酸蛋白酶并对其活性具有抑制效果的蛋白酶抑制因子。分布于各生物体内，并且在生物体的各个生理和病理过程中发挥着重要作用。比如蛋白质代谢，抗原加工，炎症反应，营养失调和新陈代谢及控制酶活力等。半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以与木瓜蛋白酶，组织蛋白酶等酸性蛋白酶形成紧密的复合物，抑制他们的活性，从而保护蛋白质的二硫键不被半胱氨酸蛋白酶破坏，组织蛋白的降解。植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂可抑制致病真菌，如赤霉菌和稻瘟病等的生长，其作用机制可能与半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制了半胱氨酸肽链内切酶的侵害有关。人类半胱氨酸蛋白酶抑制剂对肿瘤转移、病毒的感染都有抑制作用。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在动物胚胎中含量最高，可能对发育着的胚胎有保护作用。近年来有报道，半胱氨酸蛋白酶抑制剂在细胞程序性死亡中也起重要的调节作用。对于鱼类的半胱氨酸蛋白酶抑制剂有研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂能抑制杆状病毒所导致的鱼类培养细胞的死亡。除此之外，在水产品加工中可用于抑制水产品的蛋白酶活性、延长保鲜时间；半胱氨酸蛋白酶抑制剂亦可用于鱼糜加工过程，半胱氨酸蛋白酶作为导致鱼糜凝胶劣化的内源性蛋白酶之一会催化肌球蛋白重链的水解过程，导致鱼糜凝胶劣化。当半胱氨酸蛋白酶抑制剂与半胱氨酸蛋白酶相结合便可有效抑制鱼糜凝胶劣化。
[0003]目前对于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多数来源于天然蛋白质，其中卵清蛋白，乳清蛋白，血清蛋白和植物蛋白是使用最多的四种蛋白。现有研究表明，血浆蛋白具有较高的半胱氨酸蛋白酶抑制活性，是潜在的天然半胱氨酸蛋白酶抑制剂来源。但是长期以来疯牛病，禽流感等动物性疾病的盛行，严重影响了此类血浆蛋白的原料来源及其在食品加工应用中的安全性。而一些来自鱼卵中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，对于鱼卵的获得又严重的受到季节因素的影响。除了原料的来源存在问题外，对于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化的工艺依然停留在少量的水平，纯化步骤繁琐复杂，成本较高，严重影响了该抑制剂的后续发展使用。如果想要不依靠原料供应获得半胱氨酸蛋白酶抑制剂，那么就可以采用分子层面，利用基因表达的方法获得。根据现有研究，最常使用的是大肠杆菌表达，但大肠杆菌产出的蛋白大都以包涵体的形式进行分泌表达的，经过细胞破碎、包涵体破碎、蛋白复性等一系列工艺后的获得半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其活性受到了严重影响，丧失了大部分的抑制活性。这样得到的抑制剂也并没有太大的利用价值。
[0004]此外，NCBI上涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因序列，NCBI Gene ID：100152012，本专利技术基于该序列进行后续处理。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种高效表达生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，能够高效生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂；得到的蛋白具有一定的活性，能够起到明显的抑制作用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种高效表达生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，包括如下步骤：
[0007]S1、根据NCBI上半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因序列设计引物SsCyt/F和SsCyt/R，然后PCR扩增得到半胱氨酸蛋白酶抑制剂CST7；
[0008]其中，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列NCBI Gene ID：100152012；
[0009]所述引物SsCyt/F序列为：5'
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atgcgtcctgccagggtgct
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3'；
[0010]所述引物SsCyt/R序列为：5'
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tcagtgacatcggagaacag
‑
3'
[0011]S2、将所述抑制剂CST7利用引物CytF/HF和Cyt/ER进行PCR扩增，并插入Hind III和EcoR I两个酶切位点，连接形成融合片段Hind III
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CST7
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EcoR I，然后用Hind III和EcoR I对上述融合片段进行双酶切，同时对表达载体pPIC9K进行双酶切；将双酶切后的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因CST7的融合片段与双酶切的后的表达载体pPIC9K连接，再热激转入大肠杆菌HB101菌株中，鉴定正确后，获得重组质粒pPIC9K
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CST7；
[0012]其中，
[0013]所述引物CytF/HF序列为：5'
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cccaagcttatgcgtcctgccagggtgct
‑
3'；
[0014]所述引物Cyt/ER序列为：5'
‑
cggaattcgtgacatcggagaacagag
‑
3'
[0015]S3、对步骤S2获得的重组质粒pPIC9K
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CST7用Sac I酶进行线性化处理，将线性化后的重组质粒pPIC9K
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CST7电击转入毕赤酵母(GS115)菌株中，涂布于组氨酸营养缺陷型培养基RDB平板进行筛选，将生长出的菌落同时转接到MD和MM平板上，在MD和MM培养基上均能旺盛生长的菌落，经验证正确的阳性转化子即为工程菌株；
[0016]S4、对步骤S3获得的工程菌株，首先接种到BMGY培养基中，230
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250rpm，28
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30℃培养16
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24h之后，2000
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2500rpm下离心五分钟取菌体，用BMMY培养基重悬菌体继续在230
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250rpm，28
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30℃下培养72h，每24h向培养基中加入甲醇至终浓度为0.5％
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1％；将培养至终点的培养基在4500
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5000rpm下离心10min去除菌体取培养基，用镍离子亲和柱进行分离纯化，获得半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
[0017]优选方式下，步骤S2中所述大肠杆菌菌株，选用上海泽叶生物科技有限公司HB101菌种(HB101 E.coli Strain)；步骤S3中，所述毕赤酵母菌株选用北京启研生物科技有限公司产毕赤酵母菌株GS115，或者，选用巴斯德毕赤酵母CGMCC2.5688菌株，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0018]本专利技术构建的高效表达半胱氨酸蛋白酶抑制剂工程菌能够高效生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂，对表达的产物进行分离纯化后半胱氨酸蛋白酶抑制剂含量可达到80％以上。本专利技术应用于生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂领域。本专利技术有益效果在于：
[0019]1、本专利技术在毕赤酵母里构建了表达半胱氨酸蛋白酶抑制剂的体系，引入了外源基因CST7，构建的高效表达半胱氨酸蛋白酶抑制剂的工程菌，能够高效生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂，使最终纯化的得到的半胱氨酸蛋白酶抑制剂纯度达到80％以上。
[0020]2、本专利技术构建的重组质粒中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达生产半胱氨酸蛋白酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、根据NCBI上半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因序列设计引物SsCyt/F和SsCyt/R，然后PCR扩增得到半胱氨酸蛋白酶抑制剂CST7；其中，所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列NCBIGeneID：100152012；所述引物SsCyt/F序列为：5'
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atgcgtcctgccagggtgct
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3'；所述引物SsCyt/R序列为：5'
‑
tcagtgacatcggagaacag
‑
3'S2、将所述抑制剂CST7利用引物CytF/HF和Cyt/ER进行PCR扩增，并插入HindIII和EcoRI两个酶切位点，连接形成融合片段Hind III
‑
CST7
‑
EcoR I，然后用Hind III和EcoR I对上述融合片段进行双酶切，同时对表达载体pPIC9K进行双酶切；将双酶切后的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因CST7的融合片段与双酶切的后的表达载体pPIC9K连接，再热激转入大肠杆菌中，获得重组质粒pPIC9K
‑
CST7；其中，所述引物CytF/HF序列为：5'
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cccaagcttatgcgtcctgccagggtgct
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3'；所述引物Cyt/ER序列为：5'
‑
cggaattcgtgacatcggagaacagag
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：王震宇，常思佳，杜明，吴超，王嘉敏，王逐鹿，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：