一种高效生产α1-抗胰蛋白酶的方法技术

一种高效生产α1

【技术实现步骤摘要】
一种高效生产
α1‑
抗胰蛋白酶的方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质药物制备
，具体涉及一种高效生产α1
‑
抗胰蛋白酶的方法。

技术介绍

[0002]人α1
‑
抗胰蛋白酶(UniProt编号为P01009)是FDA批准上市的药物，用于治疗肺气肿、慢性阻塞性肺等疾病。另外，一些人先天具有α1
‑
抗胰蛋白酶基因的突变，因此也需要定时往血液中补充α1
‑
抗胰蛋白酶。目前上市的α1
‑
抗胰蛋白酶产品包括AralastNP、Glassia、Prolastin
‑
C、Zemaira等。
[0003]α1
‑
抗胰蛋白酶是肝细胞合成分泌的一种蛋白质。α1
‑
抗胰蛋白酶的基因发生突变，会造成α1
‑
抗胰蛋白酶从肝细胞中分泌发生障碍，造成α1
‑
抗胰蛋白酶聚集在肝细胞内质网中，引起肝炎、肝硬化等疾病。
[0004]α1
‑
抗胰蛋白酶是丝氨酸家族蛋白酶的抑制剂，能够抑制中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase)、胰酶等蛋白酶的活性。中性粒细胞弹性蛋白酶可降解肺泡弹性纤维。如果人体缺乏α1
‑
抗胰蛋白酶，中性粒细胞弹性蛋白酶的活性得不到抑制，那么会导致肺气肿、慢性阻塞性肺等疾病。静脉注入α1
‑
抗胰蛋白酶会缓解患者的症状。
[0005]一种高效生产α1
‑
抗胰蛋白酶的方法，涉及蛋白质药物制备领域。α1
‑
抗胰蛋白酶可用于治疗肺气肿药物，也可以给某些含有α1
‑
抗胰蛋白酶基因突变的人补充。另外，α1
‑
抗胰蛋白酶也有治疗新型冠状病毒肺炎的潜力。
[0006]目前，生产α1
‑
抗胰蛋白酶的方法主要包括以Cohn IV沉淀为原料制备、以聚乙二醇沉淀法进行初始制备、以聚乙二醇沉淀法结合氯化锌沉淀法进行初始制备，最后应用离子交换层析或凝胶过滤层析等手段进行进一步纯化，以获得α1
‑
抗胰蛋白酶。这些制备方法都十分繁琐，并且生产效率低，成本较高。

技术实现思路

[0007]为了解决现有α1
‑
抗胰蛋白酶的制备方法存在的制备过程繁琐、生产效率低、成本高的问题，本专利技术提供一种高效生产α1
‑
抗胰蛋白酶的方法。
[0008]本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0009]本专利技术的一种高效生产α1
‑
抗胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：
[0010]步骤一、收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液；
[0011]步骤二、将含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液进行S/D法病毒灭活，在25
±
1℃下孵育6小时
±
0.5小时，得到灭活的含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液；
[0012]步骤三、将人半乳糖凝集素8作为诱饵蛋白，将带有组氨酸标签的诱饵蛋白、灭活的含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液、Ni
‑
NTA、缓冲液混合均匀，在4℃
±
1℃下持续搅拌0.5小时
‑
4小时，使Ni
‑
NTA与诱饵蛋白的组氨酸标签结合，α1
‑
抗胰蛋白酶与诱饵蛋白发生特异性结合；
[0013]步骤四、将上述混合物于100g
‑
1000g离心1分钟
‑
10分钟收集Ni
‑
NTA，弃上清，用缓冲液清洗Ni
‑
NTA2
‑
4次，去除其他蛋白；
[0014]步骤五、将α1
‑
抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来；
[0015]步骤六、采用凝胶过滤层析进一步对α1
‑
抗胰蛋白酶进行纯化；
[0016]步骤七、收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的谱峰，进行透析脱盐浓缩；
[0017]步骤八、对浓缩后的α1
‑
抗胰蛋白酶进行巴氏灭活，在62℃
‑
65℃下孵育12小时
‑
16小时，10mM
‑
20mM甘氨酸和1％
‑
2％葡萄糖作为巴氏灭活保护剂；冻干后获得α1
‑
抗胰蛋白酶。
[0018]作为优选的实施方式，步骤一中，所述收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液的方法采用以下方法中的一种：
[0019](a)收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的人血浆、人血清、动物血浆或动物血清，加入抗凝剂，静止0.5小时
‑
4小时以形成凝块，于500g
‑
2000g离心5分钟
‑
30分钟，收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的血清；
[0020](b)收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的Cohn组分Ⅳ沉淀；
[0021](c)收集重组表达α1
‑
抗胰蛋白酶的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；
[0022](d)收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的人乳汁；
[0023](e)收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的动物乳汁。
[0024]作为优选的实施方式，(a)中，所述抗凝剂采用柠檬酸钠、肝素、EDTA或草酸钾。
[0025]作为优选的实施方式，步骤二中，所述S/D法病毒灭活时，所采用的有机溶剂为终浓度0.003g/ml
±
0.001g/ml的磷酸三丁酯，所采用的去污剂为终浓度0.01g/ml
±
0.005g/ml的吐温
‑
80。
[0026]作为优选的实施方式，步骤三中，所述带有组氨酸标签的诱饵蛋白为带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8，其制备方法如下：
[0027]将人半乳糖凝集素8的cDNA插入到质粒pET28a中，限制性内切酶的位点为NdeI和XhoI，组氨酸标签被置于人半乳糖凝集素8的N端或C端，将获得的质粒命名为pET28a_Galectin
‑
8；将质粒pET28a_Galectin
‑
8转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，并用IPTG诱导，采用Ni
‑
NTA对带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8进行纯化；所述人半乳糖凝集素8的基因来源于人或来源于基因合成；所述人半乳糖凝集素8与UniProt数据库中编号为O00214蛋白的序列一致性为100％。
[0028]作为优选的实施方式，步骤三和步骤四中，所述缓冲液的组成成分为：10mM
‑
50mM Tris、200本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效生产α1
‑
抗胰蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液；步骤二、将含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液进行S/D法病毒灭活，在25
±
1℃下孵育6小时
±
0.5小时，得到灭活的含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液；步骤三、将人半乳糖凝集素8作为诱饵蛋白，将带有组氨酸标签的诱饵蛋白、灭活的含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液、Ni
‑
NTA、缓冲液混合均匀，在4℃
±
1℃下持续搅拌0.5小时
‑
4小时，使Ni
‑
NTA与诱饵蛋白的组氨酸标签结合，α1
‑
抗胰蛋白酶与诱饵蛋白发生特异性结合；步骤四、将上述混合物于100g
‑
1000g离心1分钟
‑
10分钟收集Ni
‑
NTA，弃上清，用缓冲液清洗Ni
‑
NTA2
‑
4次，去除其他蛋白；步骤五、将α1
‑
抗胰蛋白酶从诱饵蛋白上洗脱下来；步骤六、采用凝胶过滤层析进一步对α1
‑
抗胰蛋白酶进行纯化；步骤七、收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的谱峰，进行透析脱盐浓缩；步骤八、对浓缩后的α1
‑
抗胰蛋白酶进行巴氏灭活，在62℃
‑
65℃下孵育12小时
‑
16小时，10mM
‑
20mM甘氨酸和1％
‑
2％葡萄糖作为巴氏灭活保护剂；冻干后获得α1
‑
抗胰蛋白酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中，所述收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的溶液的方法采用以下方法中的一种：(a)收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的人血浆、人血清、动物血浆或动物血清，加入抗凝剂，静止0.5小时
‑
4小时以形成凝块，于500g
‑
2000g离心5分钟
‑
30分钟，收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的血清；(b)收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的Cohn组分Ⅳ沉淀；(c)收集重组表达α1
‑
抗胰蛋白酶的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；(d)收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的人乳汁；(e)收集含有α1
‑
抗胰蛋白酶的动物乳汁。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，(a)中，所述抗凝剂采用柠檬酸钠、肝素、EDTA或草酸钾。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中，所述S/D法病毒灭活时，所采用的有机溶剂为终浓度0.003g/ml
±
0.001g/ml的磷酸三丁酯，所采用的去污剂为终浓度0.01g/ml
±
0.005g/ml的吐温
‑
80。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中，所述带有组氨酸标签的诱饵蛋白为带有组氨酸标签的人半乳糖凝集素8，其制备方法如下：将人半乳糖凝集素8的cDNA插入...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏纪勇，何恩，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：