一种基于SARS-CoV-2S蛋白的杆状病毒活载体疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因重组和疫苗技术领域，更具体地，涉及表达SARS

【技术实现步骤摘要】
一种基于SARS
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CoV
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2 S蛋白的杆状病毒活载体疫苗及其应用


[0001]本专利技术涉及基因重组和疫苗
，更具体地，涉及表达SARS
‑
CoV
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2 S基因的重组杆状病毒、构建方法和应用。

技术介绍

[0002]杆状病毒(baculovirus，BV)是一种带有环状双链DNA基因组的包膜病毒其分为三个种属目前研究最多的是一种杆状病毒多角体杆状病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)AcMNPV被广泛应用主要因为其具有以下几点优势：1)可以正确的翻译修饰；2)可以容纳多个基因或一个大片段的插入；3)安全，不会感染人类；4)具有P10和polyhedrin启动子。杆状病毒可以感染多种除血源细胞系外多种哺乳细胞，使之成为基因治疗备用军。由于杆状病毒具备对人及哺乳细胞无毒性、转导的高效性等特点，因此利用其构建的表达载体在疫苗研制、外源蛋白表达、基因治疗等方面有较大的优势。
[0003]本
技术实现思路
主要针对SARS
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CoV
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2的结构蛋白S蛋白进行免疫研究，用改造及未改造的杆状病毒作为载体在小鼠体内表达S蛋白，以研究其在小鼠体内的免疫反应，从而为疫苗临床研究提供理论基础。
[0004]在本专利技术中，我们构建了CMV启动子替代杆状病毒启动子及启动子未改造的两种杆状病毒表达人源的SARS/>‑
CoV
‑
2S基因获得重组病毒vAc
‑
S和vAc
‑
S
‑
CMV，探讨这两种方式构建的重组杆状病毒直接注射小鼠后引起的小鼠体内的细胞免疫和体液免疫反应。
[0005]
技术实现思路

[0006]本
技术实现思路
主要目的为构建安全高效的靶向SARS
‑
CoV
‑
2的疫苗，用改造及未改造的杆状病毒作为载体在小鼠体内表达S蛋白，有望成为制备严重急性呼吸窘迫综合征2疫苗的候选方式。提供含有重组转移载体pFB
‑
S
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CMV、pFB
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S。提供SARS
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CoV
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2细菌人工染色体重组质粒cAcFB
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S，cAcFB
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S
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CMV。提供重组杆状病毒vAc
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S
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CMV,vAc
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S。提供重组病毒SARS
‑
CoV
‑
2 S的构建方法。提供重组SARS
‑
CoV
‑
2病毒的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：
[0007]SARS
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CoV
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2基因组全长约29.9kbp。包括5
’
帽结构、ORF1a及ORF1b、pp1a，pp1ab由ORF1a及ORF1b编码，其进一步水解为16个非结构蛋白(nonstructural proteins，nsps)剩下的ORF区编码8种辅助蛋白(3a，3b，p6，7a，7b，8b，9b和orf14)和四种结构蛋白S、E、M、N，3
’
poly(A)尾。S蛋白是Ⅰ型融膜蛋白，其主要功能是识别受体，介导病毒进入宿主细胞。SARS
‑
CoV
‑
2的S蛋白由S1和S2两个亚基组成，弗林蛋白酶能将S蛋白切割位为S1和S2亚基，S1含与细胞受体结合的受体结合域(RBD)，负责病毒与受体血管紧张肽转化酶2(ACE2)结合。S蛋白具有高度保守的特点，使其成为疫苗研制的靶点。
[0008]本专利技术有益效果为：在本专利技术中，我们构建了未经改造的杆状病毒及经哺乳动物
启动子元件CMV启动子替代原有启动子改造的两种杆状病毒表达人源的SARS
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CoV
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2 S基因获得重组病毒vAc
‑
S和vAc
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S
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CMV，该疫苗对病毒抑制率高，安全性能好，为新冠病毒的防治提供了新思路新方法。
附图说明
[0009]图1重组杆状病毒载体构建示意图。
[0010]图2重组质粒经KpnⅠ、XholⅠ双酶切后获得的片段。
[0011]图3重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中，蓝白斑筛选后菌落PCR鉴定重组cAc
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S/cAc
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S
‑
CMV Bacmids。
[0012]图4重组cAc
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S/cAc
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S
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CMV Bacmids转染至sf9细胞后获得的病毒转导BHK细胞western
‑
blot检测S蛋白的表达。
[0013]图5在免疫小鼠后的第0，14，28，42，52天，ELISA检测了小鼠血清中SARS CoV
‑
2抗S蛋白的IgG。其中PBS组特异性抗体持续处于较低水平，vAc
‑
S及vAc
‑
S
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CMV组在免疫后28天抗体有明显的升高。第52天，vAc
‑
S及vAc
‑
S
‑
CMV免疫组抗体水平均较PBS对照组有30倍的升高，组间无显著性差异。vAc
‑
S的抗体水平略低，但在第二次加强后有所提升。空载体对照组vAc
‑
WT在免疫28天，42天后检测到一定抗体水平较PBS组有3.2倍差异，第52天后比免疫组有1.4倍的差异。
[0014]图6vAc
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S
‑
CMV免疫组CD4+阳性细胞中产生的IFN
‑
γ高于IL
‑
4水平。
[0015]图7vAc
‑
S
‑
CMV免疫组CD8+阳性细胞中产生的IFN
‑
γ高于IL
‑
4水平。
[0016]图8末次免疫后10天，利用假病毒系统对PBS、vAc
‑
WT、vAc
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S、vAc
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S
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CMV免疫小鼠的血清进行中和保护性实验，我们可以看到vAc
‑
S、vAc
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S
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CMV免疫小鼠的血清均产生了有效的中和抗体，vAc
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S免疫小鼠产生的中和抗体滴度较vAc
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S
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CMV免疫小鼠产生的中和抗体滴度高。
具体实施例
[0017]提供下面实施例的唯一目的是说明本专利技术的原理；它们决不旨在限制或缩小本专利技术的范本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杆状病毒表达SARS
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CoV
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2活病毒载体疫苗，其特征在于，包括重组转移载体pFB
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S
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CMV、pFB
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S；SARS
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CoV
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2细菌人工染色体重组质粒cAcFB
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【专利技术属性】
技术研发人员：芦宝静，李报，王倩云，刘雪娟，彭晖，朱彬彬，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：