玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用制造技术

本申请提供了玉米氮利用相关基因ZmNLP9,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在低氮胁迫抗性植物育种中的应用。本发明专利技术经过研究发现，在玉米中利用基因编辑技术敲除ZmNLP9基因能够显著提升玉米氮利用效率；本发明专利技术提供的ZmNLP9蛋白及其编码基因的这一新应用，为培育耐低氮玉米新品种提供新的种质资源，同时对于研究植物低氮应答响应分子机制和提高植物氮利用效率研究奠定了一定的理论基础。利用效率研究奠定了一定的理论基础。利用效率研究奠定了一定的理论基础。

【技术实现步骤摘要】
玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及玉米ZmNLP9蛋白及其编码基因在构建耐低氮玉米中的应用。

技术介绍

[0002]随着世界人口的迅速增加以及生活水平的不断提高，人类的粮食需求快速增加，而化肥的施用以及优良品种的选育，是粮食产量产生质的飞跃的关键因素。但是以氮肥为主的化肥大规模施用会对生态环境造成破坏，而低氮环境广泛存在与我们的耕地之中，氮素营养不存不仅会影响到植物的生长发育，更是制约玉米产量的主要非生物逆境，因此，从分子生物学角度研究玉米如何耐受低氮，了解低氮环境下玉米生理生化变化，对培育玉米耐低氮新品种显得尤为重要。
[0003]玉米作为重要的农业作物，其播种面积以及产量高居全国第一，而玉米对土壤氮肥的含量要求较高，且不具有生物固氮的能力，提升玉米的氮利用效率，增强玉米对低氮土地的耐受性，对减少农业支出和减轻环境污染有着重要的意义。研究玉米具体响应低氮胁迫的分子机制和影响其主要生理生化过程中的主效因子，可以通过敲除相关基因在玉米野生型植株中，运用相应实验方法检测该转基因植株较野生型耐低氮能力是否发生变化，能有效的发掘低氮相关的优质基因资源，从而为进一步改善玉米耐低氮能力和培育耐低氮新品种提供一定的理论依据。

技术实现思路

[0004]针对以上情况，本专利技术通过编码玉米类NIN蛋白的基因ZmNLP9(全称为NODULE INCEPTION LIKE PROTEIN 9)的研究，发现降低该基因表达的转基因植株较野生型植株具有明显耐低氮的表型。
[0005]一方面，本申请提供了玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在低氮胁迫抗性植物育种中的应用。
[0006]另一方面，玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在氮高效植物育种中的应用。
[0007]另一方面，本申请提供了增强植物对于低氮胁迫抗性的方法，包括敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达。
[0008]进一步地，所述ZmNLP9核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
[0009]进一步地，所述ZmNLP9编码的蛋白序列为SEQ ID NO.9。
[0010]进一步地，所述植物为单子叶植物。
[0011]进一步地，所述植物为玉米。
[0012]进一步地，敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达使用CRISPR方法进行。
[0013]进一步地，所述CRISPR方法包括设计gRNA序列；扩增、回收、构建载体；转入农杆菌；侵染植株。
[0014]进一步地，gRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]进一步地，以pXUE411为模板，使用序列为SEQ ID NO.2
‑
5的引物进行扩增。
[0016]构建耐低氮ZmNLP9的CRISPR/Cas9材料的方法，包括以下步骤：
[0017]1)利用CRISPR/Cas9靶点设计在线网站crispr
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P(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi
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bin/CRISPR/CRISPR)设计并筛选候选靶序列，靶序列通常要求位于CDS的保守功能域内或其上游、GC含量在45％
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75％之间；
[0018]2)利用网站CRISPR
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RGEN
‑
Tools(http://www.rgenome.net/cas
‑
offinder/)对候选靶序列进行脱靶分析，进一步筛选确定最优的、潜在脱靶率低且对其他基因编码区无影响的特异性靶序列。
[0019]3)以待选靶序列为目标，在其上下游设计特异性引物，以受体材料基因组DNA作为模板对目的基因进行扩增，对PCR产物测序进行验证，如有差异，需要修正靶序列后重新进行脱靶分析，最终选择最优靶序列进行载体构建，本专利技术所用gRNA序列为CCCTCCGCTGCGCAACAGA(SEQ ID NO.1)，所用载体为中国农业大学作物功能基因组与分子育种研究中心pXUE411。
[0020]4)载体构建后经测序检测，转化农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌侵染玉米幼胚获得转基因阳性幼苗，通过自交与测序检测获得纯合的突变材料。
[0021]本申请中所述的ZmNLP9核苷酸序列为SEQ ID NO.9、所述ZmNLP9编码的蛋白序列为SEQ ID NO.10；但与之有一个或多个核苷酸或氨基酸区别，但功能相同或者类似的变体仍然在本申请的保护范围内。
[0022]只要其中具有所述ZmNLP9基因，本申请的方法适用于各种玉米品种。
[0023]本申请中的敲除或者抑制方法，如CRISPR方法的操作细节和试剂本领域公知或者可以使用现有的试剂盒完成。
[0024]有益效果：
[0025]本专利技术提供的ZmNLP9蛋白及其编码基因为培育耐低氮玉米新品种提供了基因资源，为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。
附图说明
[0026]图1为ZmNLP9的CRISPR/Cas9材料鉴定结果。
[0027]图2为本专利技术实施例3中CRISPR/Cas9株系高低氮培养后照片。
[0028]图3为本专利技术实施例3中过表达株系高低氮培养后植株生物量和叶绿素含量统计图。
[0029]图4为表达载体pXUE411结构图谱。
具体实施方式
[0030]以下实施例便于更好地理解本专利技术，但不限于此，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本专利技术的保护范围。
[0031]除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
[0032]以下实施例中的主要试剂为：Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD、购自NEB、Toyobo等生物公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技
(北京)有限公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)等抗生素以及Glucose、BSA、LB Medium等购自Sigma、Bio
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Rad等公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。
[0033]实施例中所使用的引物由北京擎科生物科技有限公司合成，并进行相关测序。
[0034]实施例1ZmNLP9基因CRISPR/Cas9材料的构建和检测
[0035]根据ZmNLP9基因(玉米基因组数据库中的编号为GRMZM2G105004)的编码区序列分析，设计gRNA其序列为CCCTCCGCTGCGCAACAGA(SEQ ID NO.1)，并设计引物以pXUE411为模板进行四引物扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，配制酶切链接体系构建pXUE411
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ZmNLP9载体。
[0036]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在低氮胁迫抗性植物育种中的应用。2.玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在氮高效植物育种中的应用。3.增强植物对于低氮胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法包括敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达。4.根据权利要求1
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3任一项所述的应用或方法，其中所述ZmNLP9核苷酸序列为SEQ ID NO.10。5.根据权利要求4所述的应用或方法，所述ZmNLP9编码的蛋白序列为SEQ ID NO.9。6.根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：张静，陈国经纬，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：