一种高羊茅高效快速的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，包括(1)高羊茅外植体消毒、脱皮；(2)不依赖基因型的愈伤组织诱导；(3)农杆菌转化；(4)阳性愈伤筛选和再生；(5)再生苗生根、壮苗和移栽。本发明专利技术属于牧草和草坪草基因工程技术领域，具体是指一种高效快速、无基因型限制高羊茅高效快速的遗传转化方法；本发明专利技术以高羊茅种子为外植体，使用7.0mg

【技术实现步骤摘要】
一种高羊茅高效快速的遗传转化方法


[0001]本专利技术属于牧草和草坪草基因工程
，具体是指一种高羊茅高效快速的遗传转化方法。

技术介绍

[0002]高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)是禾本科牧草和草坪草两用型禾草，耐干旱，耐粗放管理，适应性广，正成为我国使用量增长最快的草种，在我国西部、北部及长江流域气候过渡区广泛种植应用。然而，现有高羊茅遗传转化效率低、严重依赖基因型，转化周期长，一般需要6个月以上，严重制约了高羊茅基因功能研究，分子育种进程。
[0003]针对目前高羊茅遗传转化周期长、效率低、受基因型限制、所用激素多、耗费大、污染重等问题，本专利技术提供一种高效快速的高羊茅遗传转化方法。

技术实现思路

[0004]1.1基本思路
[0005]针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种高效快速、无基因型限制高羊茅高效快速的遗传转化方法，该方法是将高羊茅种子为外植体，使用7.0mg
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，其特征在于：所述遗传转化方法包括如下步骤：(1)高羊茅外植体消毒、脱皮以高羊茅种子为外植体，使用纯水配置的7.0mg
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1 2,4
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D浸泡16
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20h，然后使用50％(v/v)硫酸在搅拌速度为180rpm、温度为50℃的条件下消毒25min，无菌水清洗5
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7次；在无菌环境中使用75％的酒精浸泡2min，无菌水清洗3次，再用50％(v/v)84消毒液在搅拌速度为180rpm的条件下消毒25min，无菌水清洗5
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7次，倒去多余无菌水即为脱皮后的高羊茅外植体；(2)不依赖基因型的愈伤组织诱导纵切高羊茅外植体，切割后的所述高羊茅外植体含胚组织，然后将切割后的高羊茅外植体按1cm间距均匀放置在TF
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1培养基上，于25℃进行暗培养获得高羊茅愈伤组织；(3)农杆菌转化活化培养：当步骤(2)中所述高羊茅愈伤组织直径达到0.5
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1cm，将愈伤切成体积为0.2
×
0.2
×
0.2cm的愈伤组织颗粒，均匀的放置在TF
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3培养基上，进行暗活化培养18h得到活化高羊茅愈伤组织，将活化高羊茅愈伤组织在TF
‑
2培养基上继代培养7
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28d或进行农杆菌转化；所述农杆菌转化为将活化高羊茅愈伤组织浸泡在活化后OD600为0.3
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0.5的农杆菌的转化液中，25℃抽真空5min，搅拌速度为220rpm，温度为28℃共培养30min，使用无菌纸上吸去多余的转化液后将所述活化高羊茅愈伤组织转移至铺有滤纸的TF
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4培养基上暗培养2
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3d得到高羊茅共培养愈伤组织，所述滤纸使用转化液浸泡；所述农杆菌的菌株为EHA105或者AGL1中的一种；(4)阳性愈伤筛选和再生将步骤(3)中所述高羊茅共培养愈伤组织使用含300mg/L头孢的无菌水洗涤3
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4次，再于28℃摇床晃动浸泡30分钟，最后使用无菌水清洗3
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4次，晾干2小时；转接到TF
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5培养基上，于25℃暗培养30
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45d得到未褐化且生长的阳性愈伤，将所述阳性愈伤转移到TF
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6培养基上，于25℃、光照为14h、黑暗为10h的条件下分化培养28d
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32d得到高羊茅分化组织；(5)再生苗生根、壮苗和移栽待高羊茅分化组织的叶片生长为2
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3cm时转移到TF
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7培养基上，进行生根培养28
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32d；将去除培养基的根浸泡在自来水中，练苗7
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10d，然后移栽到湿润的有机质中。2.根据权利要求1所述的一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，其特征在于：所述TF
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1培养基在N6培养基的基础上添加如下组分及浓度：1
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1.5g
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‑1酸水解络蛋白；1.0
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1.5g
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L
‑1脯氨酸；30
‑
35g
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‑1麦芽糖；7.0
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8.0mg
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L
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1 2,4
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D；0.05
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0.08mg
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L
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1 6
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AB；3.5
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4.0g
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L
‑1植物凝胶，所述TF
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1培养基pH为5.8
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5.9。3.根据权利要求2所述的一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，其特征在于：所述TF
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2培养基在N6培养基的基础上添加如下组分及浓度：1
‑
1.5g
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L
‑1酸水解络蛋白；1
‑
1.5g
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‑1脯氨酸；30
‑
35g
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L
‑1麦芽糖；5.0
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8.5mg
·
L
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1 2,4
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D；0.1
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0.2mg
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L
‑
1 6
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AB；3.5
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4.5g
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L
‑1植物凝胶，所述TF
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2培养基的pH为5.8
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5.9。4.根据权利要求3所述的一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，其特征在于：所述TF
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3培养基在二分之一的N6培养基的基础上添加如下组分及浓度：1.0
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1.5g
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‑1脯氨酸；30
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35g
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‑1葡萄糖；5.0
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6.0mg
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【专利技术属性】
技术研发人员：胡涛，王涛，莫昌茹，陈良，马光婧，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：