一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法技术

本发明专利技术涉及一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法，包括样品处理液、漂洗液、洗脱液、磁珠悬浮液、PCR buffer、引物组、酶反应混合液，解决了RNA易降解难题，操作简便，兼顾了各组分之间的兼容性，试剂盒可使受检样本通过样品处理获得稳定、完整的靶向RNA复合物，富集后的RNA复合物可直接用于后续端粒酶逆转录酶亚基hTERT mRNA基因的检测，试剂盒中在直扩酶反应体系中可将实验周期控制在30分钟以内，实现全自动化检测，本试剂盒的检测方法可灵敏的检出生物样本中hTERT mRNA的基因存在，该方法可在临床上用来对90％以上存在端粒酶活性的癌细胞进行定性及定量检测。检测。检测。

【技术实现步骤摘要】
一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学、医学检验
，特别涉及一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法。

技术介绍

[0002]端粒是染色体末端由重复序列DNA和蛋白质组成的特殊结构,其DNA序列高度保守，在细胞增殖及衰老等过程中发挥重要作用。端粒可减少染色体末端缩短，亦可避免相邻染色体末端融合，随着细胞复制次数的增多,端粒长度逐渐变短,当达到某一临界点时,使细胞退出周期并开始衰老，当端粒长度缩短到伤害DNA的临界值而细胞又无法补偿此长度缩短时，染色体稳定性变差，最终导致细胞死亡、机体衰老。
[0003]端粒酶是一种核糖核蛋白复合体,是一种特殊的逆转录酶,当其激活时,能以其自身的RNA为模板合成端粒DNA,可阻止端粒的丢失,维持端粒的长度,使细胞发展成为永生态细胞或癌细胞。在超过90％的永生化细胞和癌细胞中可检测到端粒酶活性,但在大多数正常体细胞中检测不到,这表明在永生化和癌变形成过程中端粒酶的激活是重要事件。
[0004]端粒酶由3个亚单位构成,即端粒酶RNA(hTR),端粒酶结合蛋白(TP1)和催化亚单位(hTERT)。端粒酶催化亚单位(hTERT)是端粒酶活性的决定关键部分,它的过度表达在细胞永生化和人类恶性肿瘤的发生、发展中起关键作用，因此端粒酶可以作为组织癌变及癌前病变的有效标志物。
[0005]目前，检测端粒酶活性最常用的方法分为直接检测端粒酶(蛋白及RNA的结合复合物)的活性和间接检测端粒酶(催化亚基的mRNA量)的活性。直接检测端粒酶(蛋白及RNA的结合复合物)的活性时主要检测它是否可以延伸DNA模板，然后跑胶或者探针杂交，检测DNA延伸的长度，以此来判断端粒酶的活性高低，该方法需要提取蛋白，操作较复杂，灵敏度不高；放射性同位素标记；重复性差、周期长。间接检测端粒酶(催化亚基的mRNA量)的活性灵敏度高，操作相对简便；但是在多数细胞中，端粒酶催化亚基的表达很难检测到。
[0006]传统的RNA检测试剂存在试剂兼容性问题，试剂残留的各种影响PCR扩增的抑制剂导致痕量的RNA样本很难被检出。同时繁杂的实验步骤会造成样本中RNA被RNA酶所降解，导致检测失败。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种端粒酶活性基因检测试剂盒、引物组及探针引物与检测方法，以解决上述技术问题。
[0008]本专利技术的技术方案是这样实现的：一种端粒酶活性基因检测试剂盒用引物组，包括上游引物，所述上游引物序列号包括：
[0009]Forward primer1：CTGGACGATATCCACAGGGC
[0010]Forward primer2：TGTCAAGGTGGATGTGACGG
[0011]Forward primer3：GTGGCACGGCTTTTGTTCAG
[0012]Forward primer4：GTGGCACGGCTTTTGTTCAG
[0013]Forward primer5：CAAGCTGTTTGCGGGGATTC
[0014]Forward primer6：CATCAGGGGCAAGTCCTACG
[0015]Forward primer7：AAACCTTCCTCAGCTATGCCC
[0016]Forward primer8：AACATGGACTACGTCGTGGG
[0017]Forward primer9：CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA
[0018]Forward primer10：GTGCTACGGCGACATGGAGAAC
[0019]Forward primer11：CGACGTCTTCCTACGCTTCA
[0020]Forward primer12：AAACCTTCCTCAGCTATGCCC
[0021]Forward primer13：GTCACGGAGACCACGTTTCA
[0022]Forward primer14：TGGCACGGCTTTTGTTCAGA
[0023]Forward primer15：CGTGGTGAACTTGCGGAAGACAG
[0024]Forward primer16：TTCAGCGTGCTCAACTACGA
[0025]Forward primer17：CATGGACTACGTCGTGGGAG
[0026]Forward primer18：AGCAGAGCTCCTCCCTGAAT
[0027]Forward primer19：CAAGCTGTTTGCGGGGATTC
[0028]Forward primer20：CTGGACGATATCCACAGGGC
[0029]Forward primer21：AAACCTTCCTCAGCTATGCCC
[0030]Forward primer22：TCAGCGTGCTCAACTACGAG
[0031]Forward primer23：CATGGACTACGTCGTGGGAG。
[0032]本专利技术进一步设置为：还包括下游引物，所述下游引物序列号包括：
[0033]Reverse primer1：AAGTTCACCACGCAGCCATA 20
[0034]Reverse primer2：TGTCTTCCGCAAGTTCACCA 20
[0035]Reverse primer3：AGTTCACCACTGTCTTCCGC 20
[0036]Reverse prime:4：AATGGCGAATCTGGGGATGG 20
[0037]Reverse primer5：ATCTGAACAAAAGCCGTGCC 20
[0038]Reverse primer6：ATACTCAGGGACACCTCGGA 20
[0039]Reverse primer7：CCTATGTGGGGAGTGGAAGC 20
[0040]Reverse primer8：GGCCTCGTCTTCTACAGGGA 20
[0041]Reverse primer9：CCATACTCAGGGACACCTCG 20
[0042]Reverse primer10：GTTGAAGGTGAGACTGGCTCTGATG 25
[0043]Reverse primer11：CCAGGGCCTCGTCTTCTACA 20
[0044]Reverse primer12：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21
[0045]Reverse primer13：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21
[0046]Reverse primer14：AGGGGTGAACAATGGCGAAT 20
[0047]Reverse prime本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种端粒酶活性基因检测试剂盒用引物组，其特征在于：包括上游引物，所述上游引物序列号包括：Forward primer1：CTGGACGATATCCACAGGGCForward primer2：TGTCAAGGTGGATGTGACGGForward primer3：GTGGCACGGCTTTTGTTCAGForward primer4：GTGGCACGGCTTTTGTTCAGForward primer5：CAAGCTGTTTGCGGGGATTCForward primer6：CATCAGGGGCAAGTCCTACGForward primer7：AAACCTTCCTCAGCTATGCCCForward primer8：AACATGGACTACGTCGTGGGForward primer9：CGGAAGAGTGTCTGGAGCAAForward primer10：GTGCTACGGCGACATGGAGAACForward primer11：CGACGTCTTCCTACGCTTCAForward primer12：AAACCTTCCTCAGCTATGCCCForward primer13：GTCACGGAGACCACGTTTCAForward primer14：TGGCACGGCTTTTGTTCAGAForward primer15：CGTGGTGAACTTGCGGAAGACAGForward primer16：TTCAGCGTGCTCAACTACGAForward primer17：CATGGACTACGTCGTGGGAGForward primer18：AGCAGAGCTCCTCCCTGAATForward primer19：CAAGCTGTTTGCGGGGATTCForward primer20：CTGGACGATATCCACAGGGCForward primer21：AAACCTTCCTCAGCTATGCCCForward primer22：TCAGCGTGCTCAACTACGAGForward primer23：CATGGACTACGTCGTGGGAG。2.根据权利要求1所述的一种端粒酶活性基因检测试剂盒用引物组，其特征在于：还包括下游引物，所述下游引物序列号包括：Reverse primer1：AAGTTCACCACGCAGCCATA 20Reverse primer2：TGTCTTCCGCAAGTTCACCA 20Reverse primer3：AGTTCACCACTGTCTTCCGC 20Reverse prime:4：AATGGCGAATCTGGGGATGG 20Reverse primer5：ATCTGAACAAAAGCCGTGCC 20Reverse primer6：ATACTCAGGGACACCTCGGA 20Reverse primer7：CCTATGTGGGGAGTGGAAGC 20Reverse primer8：GGCCTCGTCTTCTACAGGGA 20Reverse primer9：CCATACTCAGGGACACCTCG 20Reverse primer10：GTTGAAGGTGAGACTGGCTCTGATG 25Reverse primer11：CCAGGGCCTCGTCTTCTACA 20Reverse primer12：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21
Reverse primer13：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21Reverse primer14：AGGGGTGAACAATGGCGAAT 20Reverse primer15：TGACGCGCAGGAAAAATGTG 20Reverse primer16：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21Reverse primer17：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21Reverse primer18：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21Reverse primer19：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21Reverse primer20：GGGCATAGCTGAGGAAGGTTT 21Reverse primer21：CTATGTGGGGAGTGGAAGCC 20。3.根据权利要求1或2所述的一种端粒酶活性基因检测试剂盒用引物组，其特征在于，还包括：10～100mmol Tris
‑
HCl(pH8.0～8.8)；0.1～2μmol探针引物或0.5～1
×
SYBR Green染料；0.1～10μmol Oligo dT15；0.1～10μmol Random；0.05～1mmol EDTA；0.2～4mmol dNTP；1～20mmol dUTP；其中，上游引物含量为0.1～2μmol、下游引物含量为0.1～2μmol。4.一种端粒酶活性基因检测试剂盒用探针引物，其特征在于，所述探针引物序列号包括：荧光基团
‑
AACGCAGGAGCAGCCCGTCCCGCCG
‑
淬灭基团荧光基团
‑
CGAGGGTGAAGGCACTGTTCAGCG
‑
淬灭基团荧光基团
‑
GCTGCTCCTGCGTTTGGTGGATGAT
‑
淬灭基团荧光基团
‑
TTCCCCTGGTGCGGCCTGCTGCTG
‑
淬灭基团荧光基团
‑
CGAGGGTGAAGGCACTGTTCAGCG
‑
淬灭基团荧光基团
‑
GACTACGTCGTGGGAGCCAGAACG
‑
淬灭基团荧光基团
‑
GGCCTCCCTCTGCTACTCCATCCTGA

【专利技术属性】
技术研发人员：王金固，
申请(专利权)人：杭州拜赛思生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：