用于扩增子测序的index组合及相应测序方法技术

本申请提供了用于扩增子测序的index组合及相应测序方法，所述index满足以下条件：(1)不与靶标引物相同或互补；(2)index间不能有连续3个以上的碱基相同，各种碱基比例接近25％；(3)长度为3～7bp。本申请解决了在测序过程中由于文库碱基不平衡导致测序质量降低的问题，在引物扩增步骤中加入index后上机样本数可以大幅度增加，降低测序成本并节约测序时间。降低测序成本并节约测序时间。

【技术实现步骤摘要】
用于扩增子测序的index组合及相应测序方法


[0001]本申请属于测序方法领域，具体地，本申请提供了用于扩增子测序的index组合及相应测序方法。

技术介绍

[0002]扩增子测序常采用对多个样品加标签进行混池建库的方法进行测序，目前主流方法主要有PCR产物建库法、一步扩增法和两步扩增法。其中，PCR产物建库法：使用5
’
端或3
’
端的单端或双端含有约6～8bp的标签(index)的靶标的通用引物对基因组进行扩增，纯化靶标扩增产物，使用Qubit或qPCR方法进行定量，将约20～40个样本等量混合后进行构建一个普通DNA文库，此法引物较短，PCR扩增的保真效果好，但实验步骤繁琐，且需要经过多步的DNA建库环节，时间长、成本高。一步扩增法：使用含带有标签的单链测序接头和通用引物一起合成，在靶标扩增的同时，将PCR产物带上测序所需要的接头，即可直接得到文库，操作简便、速度快、成本低，但带上完整测序接头的单条引物长达90bp，在PCR扩增环节容易导致扩增效率低(如扩增失败，总量偏低)，出现引物二聚体、杂带，甚至会导致数据分析时的样品失真，目前关于一步扩增法的研究虽然较多，但均不能有效解决该问题。两步扩增法：使用5
’
端和3
’
端含有部分单链接头序列的通用引物进行第一步PCR扩增，然后对第一步能成功特异扩增的产物，使用含有标签和完整单链接头的引物进行第二步扩增，即可得到文库，此两步法不需要普通DNA文库构建、速度快、成本低、方便不同样品间灵活混池、个别样品灵活补测。两步法的引物设计组合最多，如标签的数量、位置，部分单链接头序列的长度、第二步PCR接头的长度等，会导致不同使用者对建库效果的偏差，如引物设计和实验反应条件不适当，两轮PCR会导致扩增偏好，扩增错误放大；引物扩增，使测序文库在首尾两端序列相同，导致文库碱基不平衡的概率大大增加，测序质量下降；每次上机受到文库index数量限制，上机样本数减少，导致每次上机成本增加。

技术实现思路

[0003]针对以上问题，本申请设计了所用于特异性较好扩增子外连index，作为第一轮扩增引物使用；Index序列的设计原则为：(1)不能与靶标引物相同或互补，以免影响引物发夹结构；(2)标签间不能有连续3个以上的碱基相同，且要求各碱基比例接近25％；(3)标签为3～7bp较适宜，过长则增加引物长度负担，过短则分辨率较低。本专利技术设计48种标签，如表1所示，经3bp、5bp、7bp的上机测序验证，均可以准确对所有样本进行准确匹配，数据拆分，满足分辨率要求。
[0004]本申请解决了在测序过程中由于文库碱基不平衡导致测序质量降低的问题。由引物扩增步骤加入，因此上机样本数可以有官方给出文库index的48倍，大大降低测序成本，实现单次上机即完成一个大项目。
[0005]表1index序列
[0006][0007][0008]一方面，本申请提供了用于扩增子测序的index组合，所述index满足以下条件：(1)不与靶标引物相同或互补；(2)index间不能有连续3个以上的碱基相同，各种碱基比例接近25％；(3)长度为3～7bp。
[0009]进一步地，所述index组合序列包括下表中的Index，或者为下表中Index中的任意两个，或者两个以上，包括但不限于三个、四个、五个等：
[0010][0011][0012]另一方面，本申请提供了使用上述index组合进行扩增子测序的方法。
[0013]进一步地，所述扩增子测序为16S rDNA测序。
[0014]进一步地，所述方法包括两轮PCR扩增。
[0015]进一步地，所述index组合位于所述方法中所用的引物中部。
[0016]进一步地，所述引物序列如SEQ ID NO.1
‑
96所示。
[0017]另一方面，本申请提供了上述index组合在制备扩增子测序试剂中的用途。
[0018]进一步地，所述扩增子测序为16S rDNA测序。
[0019]本申请中所述的“接近”25％，是指由于靶序列和设计要求等原因，各种碱基比例不可能严格地均为25％，而是应在设计允许的范围内尽可能接近25％，例如偏差不超过5％。
附图说明
[0020]图1为文库结构图，index所在位置如原点所示；
[0021]图2A、2B为实施例中测序数据质控结果图。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例详述本专利技术，但本专利技术的保护范围不局限于以下实施例。
[0023]实施例1
[0024]本专利技术是利用16s rDNA四重扩增来验证标签准确性，所提供的第一步PCR两重标签引物共有48X48＝2304种。验证实验，我们选用同一种上下游标签，共设计48种(如上面的表1所示)，引物组合如下(使用16s V3
‑
V5区扩增引物，SEQ ID NO.1
‑
96，index为引物序列中的粗体，如表2所示)。
[0025]样本选用临床样本微生物DNA，拆分过程使用QIIME样本拆分流程(官方QIIME.org说明)。
[0026]通过两轮PCR扩增，完成文库构建流程，具体操作步骤如下(以16rDNA V3
‑
V5区引物为例)，文库结构图见附图1。
[0027]PCR
‑
I扩增引物准备：
[0028]将所需扩增引物稀释到5uM浓度。
[0029]PCR
‑
I反应体系：
[0030]上、下游引物各1ul(专利index引物)；2
×
PCR Master Mix 25ul；DNA模板5ul；无核酸水18ul。
[0031]PCR
‑
I反应条件：
[0032]94℃5min；94℃1min,55℃1min,72℃1min,25cycles；72℃10min；4℃forever。
[0033]PCR
‑
I扩增反应产物纯化及定量：
[0034]0.8X beads纯化扩增产物，30ul无核酸水洗脱。Nanodrop定量后，将所有扩增产物进行等量混合，进行下一轮PCR扩增。
[0035]PCR
‑
II反应体系：
[0036]PCR
‑
I产物混合23ul(5
‑
10ng/ul)；上、下游引物各1ul；2
×
PCR Master Mix25ul。
[0037]PCR
‑
II反应条件：
[0038]98℃45sec；98℃15sec,60℃30sec,72℃30sec,8cycles；72℃10min；4℃forever。
[0039]PCR
‑
II产物纯化及文库质控：
[0040]0.8X beads纯化扩增产物，30ul本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于扩增子测序的index组合，其特征在于，所述index满足以下条件：(1)不与靶标引物相同或互补；(2)index间不能有连续3个以上的碱基相同，各种碱基比例接近25％；(3)长度为3～7bp。2.根据权利要求1所述的index组合，其中所述index组合序列包括下列index中的任意两个或者两个以上：两个或者两个以上：
3.根据权利要求2所述的index组合，其中所述index组合序列为：B01ATCB25CGTTCB02TACGCAGB26GTATAAGB03AACGTB27GCAB04TACGCGAB28GTATAGAB05TACGTTCB29GTATATCB06ACTB30CGTACB07AACTGB31CATB08TACACCTB32GTAGACGB09AACACB33GTAGACAB10TACACAGB34CTGB11TACACGAB35GTAGAGTB12AACCAB36CGTCAB13ACGAGTCB37TGAB14GTAGTB38CGTTGTCB15ACGAGCTB39TCGGTB16GGCB40CGTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张媛媛，刘婷婷，王海印，王震，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京地坛医院，
类型：发明
国别省市：