一种高灵敏度探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体涉及一种高灵敏度探针、及其制备方法和应用。该探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，所述检测探针链从5

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏度探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，具体涉及一种高灵敏度探针、其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]Northernblot(RNA印迹)是生物化学、分子生物学中常用的实验方法，通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段，是一种常用的RNA定性和定量分析方法。Northern印迹法中RNA样品经过凝胶电泳后会按照分子量大小分离，然后将样品从凝胶转印到膜上，然后用于目标序列互补的标记探针进行杂交，通过对探针信号的显影来检测目的基因的表达情况。
[0003]目前，Northern blot所用的探针方法主要有两类：一类是基于同位素的放射性标记，其具有灵敏度高、特异性好、分辨率强的优点，但是放射性同位素对人体有害，探针半衰期短，而且还需要特定的实验室及相应的试验保护设施，以及经过专门培训的人员操作，要求较高，从而导致检测成本也极高；二类是通过酶促、光化学和化学手段等掺入报告基团，这种报告基团可通过高灵敏的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统来检测。而在small RNA的检测过程中，由于所检测的small RNA长度较短，一般只有20多个核苷酸，所以相应的探针的长度也较短，对于较短的探针一般采用合成的寡核苷酸作为探针，然后对其3
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末端或5
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末端进行标记，此时一般是只标记一两个基团，可检测基团的数量直接影响了检测灵敏度。

技术实现思路

[0004]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术的目的之一在于提供了新的探针，该探针含有多个标记，检测灵敏度极高。
[0005]所提供的高灵敏度探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，所述检测探针链从5
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到3
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端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，所述标记区含有标记碱基；
[0006]所述模板探针链从3
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到5
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端依次为检测探针链互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；
[0007]所述模板探针链和检测探针链形成检测探针链5
’
端为单链的部分双链探针。
[0008]本专利技术采用双探针进行融合的方法，在其融合过程中掺入多个标记基团，其检测灵敏度可达到放射性同位素检测水平。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，标记为生物素标记或者地高辛标记。
[0010]本专利技术的目的之二在于提供上述高灵敏度探针的制备方法，包括以下步骤：
[0011]分别合成模板探针链和不含有标记区的检测探针链；
[0012]将模板探针链和不含有标记区的检测探针链在退火体系中退火形成部分双链探针前体；
[0013]将部分双链探针前体在扩增体系中扩增，即得；
[0014]其中，扩增体系中含有标记碱基且不含有与连接碱基互补的碱基。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述连接碱基为C，所述扩增体系的底物不含dGTP及其标记物；或所述连接碱基为A，所述扩增体系的底物不含dTTP及其标记物；或所述连接碱基为G时，所述扩增体系的底物不含dCTP及其标记物；或所述连接碱基为T时，所述扩增体系的底物不含dATP及其标记物。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，退火条件为：70℃保温5min，之后以0.1℃/s的降温速率降温至22℃保温5min。
[0017]本专利技术的目的之三还在于保护上述高灵敏度探针在核酸检测中的应用。
附图说明
[0018]图1为本专利技术所述的探针的结构和制备方法的示意图；
[0019]图2为实施例1
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2制备得到的探针的检测效果与现有技术的对比图，其中A为现有技术中生物素探针检测效果，B为本专利技术所用探针的检测效果；
[0020]图3为实施例3
‑
4制备得到的探针的检测效果与放射性同位素标记检测效果的对比图，其中A为放射性同位素标记的检测效果，B为本专利技术所用探针的检测效果。
[0021]图4为实施例5制备得到的探针的检测效果，其中两条泳道均为其检测结果。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0023]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[0024]在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0025]在small RNA检测过程中，由于所检测的small RNA长度极短，一般只有20多个核苷酸，所以相应的探针的长度也就较短，对于较短的探针一般采用合成的寡核苷酸作为探针，然后对其3
’
端或5
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端进行标记，而这种标记一般是标记一个基团，因此，可检测基团的数量直接影响了其检测灵敏度。基于此，本专利技术采用双探针融合的方法，在其融合过程中掺入多个标记的基团，从而大大提高了检测的灵敏度，所提供的探针的结构如下：
[0026]该探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，检测探针链从5
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到3
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端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，标记区含有标记碱基；模板探针链从3
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到5
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端依次为检测探针互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；模板探针链和检测探针链互补形成检测探针链5
’
端为单链的部分双链探针。
[0027]其制备方法如下：
[0028]首先，分别合成模板探针链和不含有标记区的检测探针链；
[0029]其次，将模板探针链和不含有标记区的检测探针链在退火体系中退火形成部分双链探针前体；
[0030]最后，再将部分双链探针前体在含有标记碱基的扩增体系中扩增，即得；
[0031]其中，扩增体系中含有标记碱基且不含有与连接碱基互补的碱基。
[0032]在本专利技术中，连接碱基的目的在于阻断标记时向检测探针的待测目的序列互补配对区合成。连接碱基可以是一个，也可以是两个或者多个，但不可以同时包含A、T、C、G四种碱基。当使用不同的模板引物进行聚合扩增时，根据引物中需标记的区域的碱基，使用不同的底物即可，如当需标记区域含有A、C、G时(即连接碱基为T)，扩增体系中只能含有与其对应互补的碱基底物T、G、C及其标记物。当然需标记的区域的碱基也不一定必须使三种碱基，不过种类少了可能易形成二级结构，影响其扩增效率。
[0033]模板探针链上的检测探针链标记区互补配对区为一端随本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏度探针，其特征在于，所述高灵敏度探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，所述检测探针链从5
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到3
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端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，所述标记区含有标记碱基；所述模板探针链从3
’
到5
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端依次为检测探针互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；所述模板探针链和检测探针链互补形成检测探针链5
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端为单链的部分双链探针。2.根据权利要求1所述的高灵敏度探针，其特征在于，标记为生物素标记或者地高辛标记。3.权利要求1～2任一项所述的高灵敏度探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分别合成模板...

【专利技术属性】
技术研发人员：李峰，王红征，王玉丹，张熙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：