一种谷胱甘肽的检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体为一种谷胱甘肽的检测方法，包括以下步骤：将盐酸多巴胺溶液与NaOH溶液混合，得到聚多巴胺纳米颗粒溶液；将可吸附在聚多巴胺上且可被谷胱甘肽解吸的靶标替代DNA、得到的聚多巴胺纳米颗粒溶液、含Zn

【技术实现步骤摘要】
一种谷胱甘肽的检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种谷胱甘肽的检测方法。

技术介绍

[0002]谷胱甘肽(GSH)即γ
‑
谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，因它有游离的
‑
SH基团，故常用GSH表示。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三个氨基酸组成的具有重要生理功能的三肽化合物，有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式。谷胱甘肽是哺乳动物细胞中最丰富的硫醇化合物，参与维持细胞氧化还原稳态，信号转导，基因调控等。谷胱甘肽在谷胱甘肽S转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的催化下，参与各种亲电化合物和过氧化物的解毒过程，把机体内有害毒物转化成无害物质排出体外，其不仅能保护血红蛋白、保护相应酶中的巯基并恢复其活性，而且具有抗衰老、中和有毒化合物等作用。若缺乏GSH将会使细胞面临氧化损伤的风险，谷胱甘肽水平的异常变化常常与癌症、囊性纤维化、帕金森病，免疫缺陷等疾病有关。据报道，肿瘤组织中GSH的浓度比正常组织高2倍，甚至在一些耐药肿瘤组织中高10倍。因此，GSH浓度的高低对于疾病诊断、医疗治疗和其他生物医学应用至关重要。
[0003]目前谷胱甘肽的检测方法有多种，如分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳、电化学分析法、比色法、质谱法、荧光法等。分光光度法是根据待测物质在特定波长或一定波长范围时的吸光度对该物质进行定性或定量分析的方法，是最早也是应用较为广泛的测定方法之一。分光光度法因为采用的常用试剂四氧嘧啶或2
‑
硝基苯甲酸没有专一性，因此存在一定的局限性；高效液相色谱法线性范围宽、选择性强、稳定性好，准确率高，但灵敏度低，毛细管电泳法操作简便，可靠性高，但灵敏度低；电化学分析法选择性差，易受其他物质干扰；比色法操作简单，但灵敏度低；质谱法操作复杂、灵敏度和选择性差。
[0004]综上，现有技术中检测谷胱甘肽的方法灵敏度低、选择性差，因此需要提供一种简便、灵敏、特异性强的方法来检测谷胱甘肽。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种谷胱甘肽的检测方法。
[0006]一种谷胱甘肽的检测方法，包括以下步骤：
[0007]S1、合成聚多巴胺：将盐酸多巴胺溶液与NaOH溶液混合，得到聚多巴胺纳米颗粒溶液；
[0008]S2、DNA吸附：将可吸附在聚多巴胺上且可被谷胱甘肽解吸的靶标替代DNA、S1得到的聚多巴胺纳米颗粒溶液、含Zn
2+
的溶液以及缓冲溶液混合，于室温孵育，得到PDANs
‑
Zn
2+
‑
靶标替代DNA聚合物；
[0009]S3、DNA解吸：将样品加入到S2得到的PDANs
‑
Zn
2+
‑
靶标替代DNA聚合物中，于室温孵育后离心，取上清，得到靶标替代DNA链；
[0010]S4、信号扩增：S3得到的靶标替代DNA链在反应体系中进行RCA反应，得到扩增产物；
[0011]S5、荧光检测：在S4得到的扩增产物中加入荧光染料，孵育后进行荧光检测。
[0012]优选的，所述靶标替代DNA的序列为5
’‑
AAAAAAAAACCCAGGTTCTCT
‑3’
。
[0013]优选的，S1中盐酸多巴胺溶液的浓度为1
‑
3mg/mL，氢氧化钠溶液的浓度为350
‑
450mM，盐酸多巴胺溶液与氢氧化钠溶液的体积比为50
‑
100:1。
[0014]优选的，S1中混合的条件为在45
‑
55℃搅拌4
‑
6h。
[0015]优选的，S2中靶标替代DNA、聚多巴胺纳米颗粒溶液、含Zn
2+
的溶液以及缓冲溶液的终体积为50uL，所述靶标替代DNA、所述聚多巴胺纳米颗粒溶液、所述含Zn
2+
的溶液的质量浓度比为1:2:1.5。
[0016]优选的，S2中孵育20
‑
50min。
[0017]优选的，S3中孵育30
‑
60min。
[0018]优选的，S4中反应体系为：7.5μL320nM的磷酸化挂锁探针，7.5μL靶标替代DNA链，3μL10
×
T4DNA连接酶缓冲溶液，10.5μL灭菌水，1.5μL350U/μL的T4DNA连接酶配成30μL总体积；
[0019]将其混合均匀后在16℃下反应1h，取10μL反应体系，加1.5μL10mM的dNTPs，2μL10
×
phi29DNA聚合酶反应缓冲溶液、6μL灭菌水和0.5μL10U/μL的phi29DNA聚合酶，在30℃下反应1h进行RCA反应。
[0020]优选的，S5中所述荧光染料为ThT。
[0021]优选的S5中孵育条件为在85
‑
105℃下孵育3
‑
8min后在2
‑
6℃孵育3
‑
8min，最后室温孵育0.5
‑
1.5h。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0023]本专利技术通过聚多巴胺桥梁的桥连作用把谷胱甘肽的检测转化为DNA的检测；利用DNA分子易于进行信号扩增的特点，结合G
‑
三链体的滚环扩增技术，不但提高酶和多肽的检测的灵敏度还避免了繁琐的地操作过程以及不稳定的反应过程，以聚多巴胺作为一个“桥梁”，把GSH的检测转化成了DNA的检测，提高了灵敏度。
[0024]在碱性有氧的环境中，盐酸多巴胺(DA)可通过氧化自聚反应生成聚多巴胺纳米颗粒(PDANs)；在中性pH下，PDANs带负电荷，DNA链也带负电荷，所以DNA链单独和PDANs结合比较困难。据报道，金属离子可以诱导ssDNA链吸附在PDANs上，由于PDANs的邻苯二酚基团是强的金属配体，金属离子也可以以不同的亲和力与DNA链的碱基和磷酸主干结合，因此DNA链在金属离子诱导作用下可以吸附在聚多巴胺颗粒上，形成“聚多巴胺桥梁”(PDANs
‑
Zn
2+
‑
ssDNA)；谷胱甘肽是一种含有巯基的硫醇，是一种强的金属离子螯合剂，可以作为配体来竞争这些金属离子，从而使ssDNA链从PDANs上解吸；解吸下来的靶标替代DNA链作为引物在酶、挂锁探针以及dNTP的作用下进行信号扩增，在扩增的产物中加入荧光染料，在特定的情况下就会发出荧光信号。
[0025]在过去的十几年里，关于PDA的研究一直很热门，其已被广泛应用于药物传递、光热治疗、组织工程、细胞粘附和生物传感等。在生物传感平台上，PDANs通过π
‑
π堆叠相互作用被广泛用作DNA组装的底物，然而，这种吸附模式容易受到其他生物分子的竞争，影响了生物传感器的性能。因为PDANs的邻苯二酚基团是理想的金属配体，所以金属配本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、合成聚多巴胺：将盐酸多巴胺溶液与NaOH溶液混合，得到聚多巴胺纳米颗粒溶液；S2、DNA吸附：将可吸附在聚多巴胺上且可被谷胱甘肽解吸的靶标替代DNA、S1得到的聚多巴胺纳米颗粒溶液、含Zn
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的溶液以及缓冲溶液混合，于室温孵育，得到PDANs
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Zn
2+
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靶标替代DNA聚合物；S3、DNA解吸：将样品加入到S2得到的PDANs
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Zn
2+
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靶标替代DNA聚合物中，于室温孵育后离心，取上清，得到靶标替代DNA链；S4、信号扩增：S3得到的靶标替代DNA链在反应体系中进行RCA反应，得到扩增产物；S5、荧光检测：在S4得到的扩增产物中加入荧光染料，孵育后进行荧光检测。2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，所述靶标替代DNA的序列为5
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AAAAAAAAACCCAGGTTCTCT
‑3’
。3.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，S1中盐酸多巴胺溶液的浓度为1
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3mg/mL，氢氧化钠溶液的浓度为350
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450mM，盐酸多巴胺溶液与氢氧化钠溶液的体积比为50
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100:1。4.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，S1中混合的条件为在45
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55℃搅拌4
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6h。5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学营，李伟，王洪瑞，白雨艳，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：