一种RNA中肌苷单碱基分辨率定量检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种RNA中肌苷单碱基分辨率定量检测的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术利用丙烯腈会选择性的与肌苷反应生成N1氰乙基肌苷(ce1I)，ce1I上的氰乙基由于破坏了氢键相互作用，会造成逆转录在该位点停止。随后通过实时定量PCR(qPCR)腺苷和肌苷在RNA序列上的差异可以被放大，以此来评估特异性肌苷位点的修饰水平。本发明专利技术方法简单、高效、灵敏度高、操作简单，可成功用于低丰度生物样品中肌苷的单碱基分辨率准确测定，为今后肌苷的功能研究和动态控制奠定了基础。动态控制奠定了基础。动态控制奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种RNA中肌苷单碱基分辨率定量检测的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种RNA中肌苷单碱基分辨率定量检测的方法。

技术介绍

[0002]肌苷是最丰富的RNA修饰类型之一，也是核酸中发现的最早的碱基修饰之一。肌苷是由次黄嘌呤形成的嘌呤核苷，由作用于RNA的腺苷脱氨酶(adenosine deaminases acting on RNA，ADARs)催化RNA双链区域中的腺苷水解脱氨基生成。这个过程也称为A
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I RNA编辑。无脊椎动物和脊椎动物的正常行为和发育都需要ADARs酶的参与。
[0003]在RNA中，肌苷有两个主要功能。tRNA反密码子上的肌苷扩大了tRNA可以识别的三联体的范围。在mRNA中，肌苷可以改变双链区域的三维结构，从而影响与RNA结合蛋白的相互作用。肌苷由于可以和胞苷(cytidine，C)配对，因此被认为是鸟苷(guanosine，G)，从而可以影响转录和翻译的准确性。因此肌苷是翻译效率和准确性的主要调节因子，有助于跨物种蛋白质组的多样性。A
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I RNA编辑对于许多生物学过程至关重要，如免疫系统激活和神经功能。因此它的失调与自身免疫性疾病、神经系统疾病和几种类型的癌症直接相关。
[0004]鉴定肌苷的方法很多。液相色谱
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电喷雾串联质谱(LC
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ESI
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MS/MS)是一种高效的定量方法，但它需要事先纯化大量RNA，并且依赖昂贵的仪器设备。而且LC
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ESI
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MS/MS法也不能提供肌苷修饰具体的位置信息。特异性RNA酶(如RNA酶T1和核酸内切酶V)可用于切割含肌苷的RNA，并且后续可通过凝胶电泳分离酶切后的RNA。尽管酶切法操作简单且花费少，但这种方法的通量很低并且不是完全定量的。鉴定A
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I RNA编辑位点的最常用方法是将测序得到的cDNA序列与相应的基因组序列进行比较。由于肌苷可以与C配对，如果基因组序列中的腺苷(adenosine，A)在cDNA序列中的相应位点被G取代，则该位点可能是A
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I RNA编辑位点。然而，这种方法难以排除由PCR错误、测序错误或背景干扰引起的A至G突变。研究者们开发了一种基于生物化学的方法，肌苷化学擦除测序法(inosine chemical erasure sequence，ICE
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seq)。当总RNA中的肌苷与丙烯腈反应时，产物N1氰乙基肌苷(N1
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cyanoethylinosine，ce1I)将阻止逆转录进行。肌苷位点可以通过比较从有和没有丙烯腈处理的相同样品中获得的两组RNA序列数据来确定。然而，该方法不能检测多个紧邻的肌苷修饰位点。虽然这些测序方法可以对肌苷修饰进行定位，但它们无法量化单个位点处的肌苷修饰水平。
[0005]腺苷的脱氨作用改变了碱基的分子结构和氢键模式，导致肌苷与C配对，从而将这些位点重新编码为G。RNA中的肌苷通过迈克尔加成反应与丙烯腈进行氰乙基化，形成ce1I。生成的N1氰乙基破坏了原始氢键模式，导致ce1I不能与其他碱基配对，造成逆转录停止。因此，本专利技术基于这一现象建立了一种定量生物样品中特异性位点肌苷修饰的方法。RNA在逆转录前用丙烯腈处理，如果含有肌苷修饰，则产生的ce1I会阻断逆转录，如果不含肌苷修饰则逆转录将正常进行。逆转录的终止将导致延伸产物的数量减少，通过后续的实时定量PCR(real
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time quantitative PCR，qPCR)就可以检测和评估RNA中给定位点的肌苷水平。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决现有技术存在的问题，提供一种RNA中肌苷单碱基分辨率定量检测的分析方法，即一种能应用于RNA修饰单碱基分辨率定量领域中，具有高灵敏度、高选择性且操作简便的特异性位点的肌苷定量方法。
[0007]本专利技术原理见图1，本专利技术提出了一种通过丙烯腈标记介导的延伸停止法(ALES)对RNA中肌苷进行单碱基分辨率的位点特异性定量。在ALES法中，RNA中的肌苷(I)首先与丙烯腈氰乙基化形成ce1I，ce1I产生的N1氰乙基可以抑制Watson
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Crick碱基配对；而RNA中的未经肌苷修饰的腺苷(A)可以正常进行碱基配对。因此，在逆转录过程中，用Bst 3.0DNA聚合酶进行扩增，含有肌苷的RNA延伸将在ce1I位点停止，含有A的RNA能够正常延伸，通过逆转录以区分肌苷和腺苷。后续可以通过qPCR放大肌苷与腺苷之间的差异，便于定量评估含有肌苷的RNA的量。凭借ce1I的这一特性，可以实现单碱基分辨率检测RNA中肌苷水平的目的。
[0008]利用qPCR实现单碱基分辨率定量分析肌苷的原理：某位点处的肌苷修饰水平的计算公式为I％＝(某RNA的总量
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含有A的某RNA的量)/某RNA的总量。当用Bst 3.0DNA聚合酶扩增未经氰乙基化处理的RNA样品时，可通过qPCR测定某RNA的总量。当RNA样品用丙烯腈处理时，通过qPCR测定的就是含有A的某RNA的量。因此，只需要将样本一分为二，一份加丙烯腈处理，另一份不加丙烯腈处理，然后进行逆转录及qPCR，根据Ct值及绘制的定量方程就可以实现肌苷的单碱基分辨率定量分析。
[0009]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0010]一种RNA中肌苷单碱基分辨率定量检测的方法，包含如下步骤：
[0011](1)将待检RNA均分为两份，一份用丙烯腈进行氰乙基化处理，一份不进行氰乙基化处理(只加对应的缓冲液，不加丙烯腈)。
[0012](2)向两份样品中分别加入DNA探针，该探针一部分与目标RNA位点下游互补配对，另一部分用于后续的PCR扩增。用Bst 3.0DNA聚合酶对两份RNA样品分别进行逆转录。
[0013](3)根据DNA探针的一部分及生成的DNA的下游序列设计qPCR引物，然后将逆转录的产物进行qPCR，计算RNA的量。未进行氰乙基化处理的RNA，通过qPCR测定的是RNA的总量；经氰乙基化处理的RNA，通过qPCR测定的是含有A的RNA的量。待检RNA某位点处的肌苷修饰水平通过下述公式计算：
[0014]肌苷修饰水平I％＝(RNA的总量
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含有A的RNA的量)/RNA的总量。
[0015]步骤(1)中，待检RNA用丙烯腈进行氰乙基化处理，包括如下步骤：
[0016]1)配制反应体系：30μL CE溶液(50％乙醇，1.1M三乙基乙酸铵缓冲液，pH 8.6)，4μL丙烯腈，1
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10μg待检RNA，总体积为38μL。反应体系置于70℃，反应45分钟。
[0017]2)将反应体系置于冰上结束反应，然后将体系置于氮吹仪下除去有机溶剂。
[0018]3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RNA中肌苷单碱基分辨率定量检测的方法，其特征在于：包含如下步骤：(1)将待检RNA均分为两份，一份用丙烯腈进行氰乙基化处理，一份不进行氰乙基化处理；(2)向两份样品中分别加入DNA探针，用Bst 3.0DNA聚合酶对两份RNA样品分别进行逆转录；所述的DNA探针一部分与目标RNA位点下游互补配对，另一部分用于后续的PCR扩增；(3)将逆转录的产物进行qPCR，计算RNA的量；未进行氰乙基化处理的RNA，通过qPCR测定的是RNA的总量；经氰乙基化处理的RNA，通过qPCR测定的是含有A的RNA的量；待检RNA某位点处的肌苷修饰水平通过下述公式计算：肌苷修饰水平I％＝(RNA的总量
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含有A的RNA的量)/RNA的总量。2.根据权利要求1所述的RNA中肌苷单碱基分辨率定量检测的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁必锋，丁姜慧，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：