淡水水体细菌膦酸酯代谢关键基因（phnJ）的检测引物、试剂盒及定量方法技术

本发明专利技术公开了一种淡水水体细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测引物、试剂盒及定量方法。利用本发明专利技术的检测引物按照本发明专利技术的检测方法能够定量检测淡水水体样本中细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的丰度，是首款针对膦酸酯代谢通路的分子检测方法。本发明专利技术的检测引物和定量方法具有灵敏度高、准确性强、重复性好、特异性强的特点，定量检测线性范围可达103‑

【技术实现步骤摘要】
淡水水体细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测引物、试剂盒及定量方法

：
[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种淡水水体细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测引物、试剂盒及定量方法

技术介绍
：
[0002]溶解性有机磷是水生生物重要的磷源，其由含C
‑
P键的有机膦酸酯(phosphonate)与含磷脂键(C
‑
O
‑
P键)的磷酸酯类化合物(phosphoester)组成。通常认为，磷酸酯类化合物可被生物高效利用供磷，而膦酸酯类化合物因其含化学结构稳定的C
‑
P键，可抵抗各种水解、酶解与光分解，常被归为生物不可利用磷。野外调查发现，水体中存在膦酸酯的快速清除，因此其利用过程也已成为有机地球化学研究的重要谜团之一。近期研究显示，微生物基于C
‑
P键裂解酶途径的膦酸酯降解，是水体膦酸酯利用的主要贡献者；其中C
‑
P键裂解酶途径主要依赖膦酸酯降解(phosphonate degradation，phn)基因簇完成。微生物对膦酸酯的利用，是其对低磷环境适应性演化的关键特征，也构成了水体磷循环的重要环节。此外，微生物对甲基膦酸(一种常见的生物源膦酸酯)的利用，可产生温室气体甲烷，对全球变暖存在潜在风险。因此，对水体微生物磷酸酯利用过程的解析，具有较高研究价值，也获得了越来越多的国内外学者的关注。
[0003]然而，在目前的研究中，尚缺乏对水体微生物磷酸酯利用过程的追踪与定量方法。荧光定量PCR方法以其特异性强、灵敏度高、定量准确、重复性好、速度快等优点成为了环境中定量检测的首选分子生物学方法。
[0004]因此，建立荧光定量PCR方法定量检测水体中微生物膦酸酯降解(phn)基因簇丰度成为了当前研究的重点与技术难点之一。

技术实现思路
：
[0005]又鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有对水环境中膦酸酯降解(phn)基因簇直接定量的技术的空缺，提供了一种膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测引物、试剂盒和定量方法，快速定量检测水环境中膦酸酯降解(phn)基因簇丰度。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测引物，所述的检测引物如下所示：
[0007]上游引物1:5
’‑
GACGAACAGACCAARCGCATGAT
‑3’
；
[0008]上游引物2:5
’‑
ATGCCSATGCCYTATGGSTGGGG
‑3’
；
[0009]上游引物3:5
’‑
CCCTATGGYTGGGGCAC
‑3’
；
[0010]下游引物1:5
’‑
GGTGACGGGTCTGGATCAC
‑3’
；
[0011]下游引物2:5
’‑
CGACCTTSACCGGRTAGGC
‑3’
；
[0012]下游引物3:5
’‑
GGATCGGCACCTGRTAGAC
‑3’
。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测试剂盒，包括
Green ProTaq HS Premix、阳性标准品和检测引物，所述的阳性标准品为含如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.9所示序列的重组质粒DNA序列，所述的检测引物为权利要求1所述的检测引物。
[0014]本专利技术的第三个目的是提供一种膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测方法，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，加入所述的检测引物，与Green ProTaq HS Premix和ROX染料混合形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断待测样品中膦酸酯代谢关键基因(phnJ)丰度。
[0015]所述的扩增反应体系优选为：权利要求1所述的5μM对应引物对各1μL、Green ProTaq HS Premix 10μL、模板DNA 1μL、ROX染料0.08μM，并用超纯水补至20μL；所述的荧光定量PCR反应，其反应条件优选为：95℃预变性60s；95℃变性15s，63℃退火30s，72℃延伸30s，收集荧光信号强度，重复40个循环。
[0016]本专利技术的第四个目的是提供一种膦酸酯代谢关键基因(phnJ)丰度的定量方法，包括以下步骤：
[0017](1)将如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.9所示的序列分别连接到质粒上，构建得到三种重组阳性质粒，将阳性质粒分别进行梯度稀释以用作不同起始质粒浓度的模板，分别加入对应的检测引物，与Green ProTaq HS Premix和ROX染料混合形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应；
[0018](2)反应结束后得到各起始质粒浓度模板对应的扩增循环数CT值，该CT值与起始质粒浓度的常用对数呈线性关系，据此得到膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的qPCR标准曲线；
[0019](3)提取待测样品的基因组DNA作为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述检测引物，与Green ProTaq HS Premix和ROX染料混合形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后得到CT值，将其代入膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的qPCR标准曲线，计算得到待测样品中对应细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的丰度。
[0020]步骤(1)和(3)所述的扩增反应体系优选为：权利要求1所述的5μM对应引物对各1μL、Green ProTaq HS Premix 10μL、模板DNA 1μL、ROX染料0.08μM，并用超纯水补至20μL；所述的荧光定量PCR反应，其反应条件优选为：95℃预变性60s；95℃变性15s，63℃退火30s，72℃延伸30s，收集荧光信号强度，重复40个循环。
[0021]本专利技术的实验结果表明：利用本专利技术的检测引物按照本专利技术的检测方法能够定量检测样本中对应门类细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)丰度，最低检测限为103拷贝/μL。本专利技术的检测引物和方法具有灵敏度高、准确性强、重复性好、特异性强的特点，定量检测线性范围可达103‑
109拷贝/μL。
附图说明：
[0022]图1为1％琼脂糖凝胶电泳检测普通PCR引物特异性结果；M为DL2000Marker，泳道1、2为假单胞菌目(Pseudomonadales)phnJ基因引物扩增结果，条带大小为288bp；泳道5、6为根瘤菌目(Rhizobiales)phnJ基因引物扩增结果，条带大小为409bp；泳道3、4为红螺菌目(Rhodospirillales)phnJ基因引物扩增结果，条带大小为250bp；
[0023]图2为荧光定量PCR溶解曲线分析图：图2A假单胞菌目(Pseudo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种淡水水体细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：上游引物1:5
’‑
GACGAACAGACCAARCGCATGAT
‑3’
；上游引物2:5
’‑
ATGCCSATGCCYTATGGSTGGGG
‑3’
；上游引物3:5
’‑
CCCTATGGYTGGGGCAC
‑3’
；下游引物1:5
’‑
GGTGACGGGTCTGGATCAC
‑3’
；下游引物2:5
’‑
CGACCTTSACCGGRTAGGC
‑3’
；下游引物3:5
’‑
GGATCGGCACCTGRTAGAC
‑3’
。2.一种淡水水体细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测试剂盒，包括Green ProTaq HS Premix、阳性标准品和检测引物，其特征在于，所述的阳性标准表为含有如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.9所示序列的重组质粒DNA序列，所述的检测引物为权利要求1所述的检测引物。3.一种淡水水体细菌膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，根据实验需求加入权利要求1所述的检测引物，与Green ProTaq HS Premix混合形成扩增反应体系，进行荧光定量PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断待测样品中酸酯代谢关键基因(phnJ)的丰度。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的根据扩增曲线判断待测样品中酸酯代谢关键基因(phnJ)的丰度为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，且CT值小于30，则说明待测样品中膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的丰度不低于103，膦酸酯代谢关键基因(phnJ)的丰度低于103。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增反应体系为：每20μL包括以下组分：权利要求1所述的5μM对应引物对各1μL、Green ProTaq HS Premix 10μL、模板DNA 1μL、ROX染料0.08μM，并用超纯水补至20μL；所述的荧光定量PCR反应，其反应条件为：95℃预变性60s；95℃变性15s，63℃退火30...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亮，李春连，曾莹，朱家辉，贾璞，束文圣，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：