基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNALet-7a的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNA Let

【技术实现步骤摘要】
基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNA Let
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7a的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及基因检测，特别是指基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNA Let
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7a的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]MicroRNA（miRNA）是含有约18
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22个碱基的内源性的短的非编码RNA，在不同的生理过程中起着重要作用。例如，它们可以调节细胞增殖、分化、凋亡和代谢。许多证据表明，miRNA可以调节基因表达，并且miRNA的表达与许多生理机能的发挥有关，其浓度变化与心血管、神经、自身免疫的生长和发育有关。
[0003]Let
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7miRNA最早是在秀丽隐杆线虫中发现的，并充当细胞发育的时间调节因子。Let
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7 miRNA 家族有12个成员，包括从let
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7a到let
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7i。其中，Let
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7a由于其巨大的研究潜力和代表性而正在深入研究。然而，由于miRNA的序列同源性强，浓度低且易于降解，想要实现对miRNA的高灵敏度检测并不容易。现有的miRNA Let
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7a的检测方法并不能精确、灵敏的检测miRNA。已有研究人员通过多种恒温扩增技术，提高核酸检测的灵敏度；专利一种用于QCM检测miRNA Let
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7a的试剂盒及方法，通过在QCM的基础上添加信号增强剂进而实现提高检测准确性的目的，该专利属于电化学传感器领域，其检测灵敏度有待提高；专利基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let
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7a检测试剂盒及其使用方法，为本课题组前期的研究成果，公开了一种在外切酶的帮助下实现对Let
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7a检测的试剂盒，由于含酶的检测方法在实际检测中要求的条件比较苛刻；因此，本课题组致力于开发新的不依靠酶实现提高检测miRNA Let
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7a灵敏度的目的。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNA Let
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7a的试剂盒及其应用。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNA Let
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7a的试剂盒，包括以下DNA序列：A1、A2、A3、AP、H1、H2、F和Q，磁珠混合液以及PBS缓冲液和BSA溶液；其中A1序列如SEQ ID No.1所示、A2序列如SEQ ID No.2所示、A3序列如SEQ ID No.3所示，其5
’
端修饰有生物素、AP序列如SEQ ID No.4所示、H1序列如SEQ ID No.5所示、H2序列如SEQ ID No.6所示、F序列如SEQ ID No.7所示，其5
’
端修饰有荧光基团、Q序列如SEQ ID No.8所示，其3
’
端修饰有猝灭基团。
[0006]上述磁珠混合液中的磁珠为经修饰链霉亲和素的磁珠，浓度为5mg/mL，购自天津贝乐。
[0007]上述PBS缓冲液的浓度为1mM，pH为7.4，BSA溶液的浓度为0.4mg/mL。
[0008]上述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let
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7a中的应用，步骤如下：
（1）将A1溶液、A2溶液和A3溶液混合后，经37℃孵育90分钟得三链复合结构M；（2）将磁珠混合液加入PBS缓冲液（1mM,8mM Na2HPO4,136mM NaCl,2mM KH2PO4,2.6Mm KCl，pH=7.4）中再与步骤（1）的三链复合结构M混合，在37℃条件下振荡反应30分钟后，用磁铁吸附磁珠，除去上清液，并将磁珠重新分散到含有BSA的溶液中，在37℃条件下反应一段时间，再次吸走磁珠，用PBS缓冲液浸洗三次后，重新分散至PBS缓冲液中，得到三链DNA修饰的复合磁珠M
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MB溶液；（3）将步骤（2）的复合磁珠M
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MB溶液与待检测液混合，并加入PBS缓冲液和AP溶液，振荡反应后去除磁珠，得反应液；（4）向步骤（3）的反应液中加入H1溶液和H2溶液，反应后加入F
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Q双链溶液，继续反应至完全，然后进行荧光测定，代入标准曲线获得miRNA Let
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7a的浓度。
[0009]上述步骤（1）中A1溶液、A2溶液和A3溶液的浓度均为1
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10μM，体积相同。
[0010]上述步骤（2）中磁珠混合液（5mg/mL,天津贝乐思）为已修饰生物素的磁珠混合液，PBS缓冲液的浓度为10mM；磁珠混合液和PBS缓冲液的体积比为10:7；三链复合结构M的终浓度为1
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10 μM BSA溶液的浓度为0.4mg/mL；复合磁珠M
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MB溶液的浓度为0.3 μM。
[0011]上述步骤（3）中复合磁珠M
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MB溶液、待检测液PBS缓冲液和AP溶液的体积比为10:1:5:1；PBS缓冲液的浓度为10mM；AP溶液的浓度为1
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10μM；上述步骤（4）中反应液、H1溶液、H2溶液和F
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Q双链溶液的体积比为150
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170:10:10:20；H1溶液和H2溶液的浓度均为1μM；F
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Q双链溶液的浓度为0.5μM；上述F
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Q双链是由带有荧光基团F链与带有猝灭基团的Q链等比例在37℃条件下孵化90分钟获得的。
[0012]上述步骤（4）中荧光测定的波长为492nm，发射范围490
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650nm；标准曲线为F=17020.3LgC +54246.1，R2=0.9980。
[0013]上述应用的检测原理为：表面修饰链霉亲和素的磁珠可与5
’
端修饰有生物素的DNA链A3连接。基于碱基互补配对原理，三条DNA链A1、A2、A3可在磁珠表面可以形成一个简单三链结构。其中，用于长DNA链（AP）置换的趾部分被双链封闭。当目标存在时，Let
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7a基因将触发链A2置换下来，使得趾部分暴露。接着，AP可将目标基因置换下来，而目标基因则可以继续将下一个A2置换下来，从而开启SDR循环。随后，利用磁铁将磁珠去除，所得溶液中含大量且单一的A2。A2则可以打开发夹探针H2，并使H2的功能部分暴露。发夹探针H1由于和H2配对更为紧密而被H2裸露的功能部分打开，最终使得A2脱离H2，参与下一个循环。H1裸露出可与5
’
端修饰有荧光基团的F链完全配对的碱基部分，将F链从F
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Q双链中争夺下来，使得F链与3
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端修饰有猝灭基团的猝灭链Q远离，荧光信号最终获得恢复，以此达到检测目标基因的目的。
[0014]本专利技术具有以下有益效果：（1）利用磁珠生物亲和性，将序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNA Let
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7a的试剂盒，其特征在于，包括以下DNA序列：A1、A2、A3、AP、H1、H2、F和Q，磁珠混合液以及PBS缓冲液和BSA溶液；其中A1序列如SEQ ID No.1所示、A2序列如SEQ ID No.2所示、A3序列如SEQ ID No.3所示，其5
’
端修饰有生物素、AP序列如SEQ ID No.4所示、H1序列如SEQ ID No.5所示、H2序列如SEQ ID No.6所示、F序列如SEQ ID No.7所示，其5
’
端修饰有荧光基团、Q序列如SEQ ID No.8所示，其3
’
端修饰有猝灭基团。2.根据权利要求1所述的基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNA Let
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7a的试剂盒，其特征在于：所述磁珠混合液中的磁珠为经修饰链霉亲和素的磁珠。3.根据权利要求2所述的基于磁珠和靶向无酶双扩增检测miRNA Let
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7a的试剂盒，其特征在于：所述PBS缓冲液的浓度为1mM，pH为7.4，BSA溶液的浓度为0.4mg/mL。4.权利要求1
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3任一项所述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let
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7a中的应用，其特征在于，步骤如下：（1）将A1溶液、A2溶液和A3溶液混合后，经37℃孵育90分钟得三链复合结构M；（2）将磁珠混合液加入PBS缓冲液中再与步骤（1）的三链复合结构M混合，37℃振荡反应后，分离并收集磁珠，分散于BSA溶液，继续反应后，再次收集磁珠，并用BSA溶液浸洗后分散至PBS缓冲液中，得到三链DNA修饰的复合磁珠M
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MB溶液；（3）将步骤（2）的复合磁珠M
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MB溶液与待检测液混合，并加入PBS缓冲液和AP溶液，振荡反应后去除磁珠，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎泓波，章鑫怡，方莹，王倩，徐俊，王素琴，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：