一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法，所述鉴定方法包括用引物SSR1、引物SSR2或引物SSR3对从薄皮甜瓜中提取的DNA进行扩增；引物SSR1，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；引物SSR2，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；引物SSR3，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。该专利公开的鉴定方法，能够特异性的鉴定翡翠绿宝、鲜脆1号、鲜甜脆瓜和白美1号的杂交种子纯度，且准确度高、速度快，适于推广应用。应用。应用。

【技术实现步骤摘要】
一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法


[0001]本专利技术涉及种子纯度鉴定
，具体涉及一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法。

技术介绍

[0002]甜瓜是一年生草本植物，中国甜瓜的产量在世界范围内占据很大的比例，其中薄皮甜瓜的种植面积也在不断增加，因此薄皮甜瓜种子的需求日益增大，甜瓜种子大多数为杂交种，保障种子的纯度刻不容缓。
[0003]种子纯度的鉴定通常采用大田形态学鉴定，但是周期长，难度大，用地多，可信度不高。随着分子生物学技术的快速发展，可利用AFLP、RAPD、SSR等分子标记技术进行纯度鉴定，其中SSR(Simple Sequence Repeat)分子标记具有多态性高、数量丰富、重复性好、呈共显性遗传等特点，已广泛应用到多种作物杂交种的纯度鉴定中。
[0004]目前，宁波市农业科学研究院蔬菜研究所自主选育的薄皮甜瓜杂交一代品种翡翠绿宝、鲜脆1号、鲜甜脆瓜和白美1号，具有中心糖高、长势稳健，品质优，坐果率高、抗病性好等特色，深受瓜农喜爱。探索出一种可以特异型鉴定上述四种甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法显得尤为必要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法，以解决目前不能快速、准确的鉴定出翡翠绿宝、鲜甜脆瓜、白美1号和鲜脆1号甜瓜杂交种种子纯度的问题。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法，所述鉴定方法包括用引物SSR1、引物SSR2或引物SSR3对从薄皮甜瓜中提取的DNA进行扩增；所述引物及其核苷酸序列信息如下：引物SSR1，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；引物SSR2，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；引物SSR3，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0007]进一步地，所述引物SSR1用于鉴定翡翠绿宝杂交种子纯度；所述引物SSR2用于鉴定鲜脆1号杂交种子纯度；所述引物SSR3用于鉴定鲜甜脆瓜和白美1号杂交种子纯度。
[0008]进一步地，鉴定方法具体包括以下步骤：(1)对单株甜瓜幼苗进行甜瓜基因组DNA的提取和质量检测；(2)以上述步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用如权利要求1中所述的引物进行PCR扩增；
(3)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测；(4)对电泳结果进行分析，然后根据电泳结果计算种子的纯度。
[0009]进一步地，所述步骤(1)中甜瓜基因组提取和质量检测的具体方法如下：选择籽粒饱满且大小一致的翡翠绿宝、鲜甜脆瓜、白美1号和鲜脆1号甜瓜杂交种和父母亲本种子，进行播种，待长出子叶时，将子叶研磨成浆，用CTAB法提取基因组DNA，后用Nanodrop2000超微量分光光度计检测DNA质量。
[0010]进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的具体方法如下：PCR扩增采用的反应体系包括：甜瓜基因组DNA 1μL，2
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Easy Taq PCR Super Mix 12.5μL，正反引物各1μL，加入灭菌的超纯水至25μL；在PCR扩增程序为94℃预变性3min；然后进行30个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；延伸2min后置于4℃保存。
[0011]进一步地，所述步骤(4)中电泳分析方法和纯度计算方法如下：当母本表现为一种特征条带，父本表现为相异于母本的另一种特征条带，真正杂交种表现为同时具有母本和父本特征条带的集合，否则为假杂种。
[0012]品种纯度＝待测甜瓜杂交种子粒群中属于真正杂交种个体数/待测甜瓜杂交种子籽粒群个体数
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100％本专利技术的有益效果为：1、本专利技术提供的一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法，该方法使用三组引物SSR1、引物SSR2和引物SSR3，可以分别对翡翠绿宝、鲜脆1号、鲜甜脆瓜和白美1号的杂种一代中快速检测出真正杂交种，且特异性强。
[0013]2、本专利技术提供的一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法，可将薄皮甜瓜杂交种与其父母本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度，具有准确、快速、成本低、鉴定周期短，操作简便等优点，具有广阔的应用前景。
[0014]3、本专利技术提供的一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法，在鉴定过程中，提取子叶的DNA即可，避免了使用胚根提取过程中配制复杂提取液的步骤，同时也不需要使用，减少了实验人员的操作步骤，节省工作量，另一方面不需要培养种子到新叶长出的阶段，整体上节省了时间。
附图说明
[0015]图1是本专利技术实施例1翡翠绿宝甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR1扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；其中M：DL 2000bp Marker；P1：翡翠绿宝母本；P2：翡翠绿宝父本；4～52：翡翠绿宝杂交种编号；图2是实施例1鲜脆1号甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR2扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；其中M：DL 2000bp Marker；P1：鲜脆1号母本；P2：鲜脆1号父本；4～52：鲜脆1号杂交种编号，方框中标注的样本为与母本带型一致的假杂种；图3是实施例1鲜甜脆瓜甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR3扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；
其中M：DL 2000bp Marker；P1：鲜甜脆瓜母本；P2：鲜甜脆瓜父本；4～52：鲜甜脆瓜杂交种编号；图4是实施例1白美1号甜瓜种子纯度鉴定中利用引物SSR3扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱；其中M：DL 2000bp Marker分子量标准；P1：白美1号母本；P2：白美1号父本；4～52：白美1号杂交种编号。
具体实施方式
[0016]实施例1本实施例提供一种用于鉴定薄皮甜瓜品种翡翠绿宝、鲜甜脆瓜、白美1号和鲜脆1号甜瓜杂交种子纯度的SSR引物及方法：(1)甜瓜基因组DNA的提取与检测：选择籽粒饱满且大小一致的翡翠绿宝、鲜甜脆瓜、白美1号和鲜脆1号甜瓜杂交种各100粒和其对应的父本、母本种子各1粒，进行播种。
[0017]待长出子叶时，分别将各甜瓜品种对应的0.1g子叶置于2mL离心管中研磨成浆，加入1000μL的CTAB提取液并在65℃条件下水浴15min，期间颠倒混匀2～3次，之后继续向各个离心管中加入1000μL氯仿并剧烈震荡，然后在12000r/min下离心10min，重复离心2次。
[0018]取上述离心后的上清液至新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇进行沉淀，12000r/min下离心10min，弃上清，用75％乙醇溶液洗涤沉淀后在12000r/min下离心5min后弃去上清，晾干底部沉淀，并将沉淀用50μL去离子水进行充分溶解，后用Nanodrop2000超微量分光光度计检测DNA质量。
[0019](2)PCR扩增及检测PCR扩增采用的反应体系包括：步骤(1)中提取的翡翠绿宝、鲜甜脆瓜、白美1号和鲜脆1号甜瓜基因组D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种薄皮甜瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括用引物SSR1、引物SSR2或引物SSR3对从薄皮甜瓜中提取的DNA进行扩增；所述引物及其核苷酸序列信息如下：引物SSR1，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；引物SSR2，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示；引物SSR3，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO .5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示。2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物SSR1用于鉴定翡翠绿宝杂交种子纯度；所述引物SSR2用于鉴定鲜脆1号杂交种子纯度；所述引物SSR3用于鉴定鲜甜脆瓜和白美1号杂交种子纯度。3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)对单株甜瓜幼苗进行甜瓜基因组DNA的提取和质量检测；(2)以上述步骤（1）提取的基因组DNA为模板，采用如权利要求1中所述的引物进行PCR扩增；(3)将扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳检测；(4)对电泳结果进行分析，然后根据电泳结果计算种子的纯度。4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧全宇，马二磊，郝芳敏，丁伟红，王毓洪，黄芸萍，
申请(专利权)人：宁波市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：