一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种表达SLAMF7

【技术实现步骤摘要】
一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗
，具体涉及一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]肝细胞癌(HCC)是最常见的肝癌组织学亚型。据统计，只有15％
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20％的HCC病例在早期被诊断，大多数晚期患者被诊断为不可切除的晚期HCC、肉眼可见的血管侵犯和肝外扩散，因此在实际临床治疗中存在相当大的挑战。目前使用索拉非尼、乐伐替尼和瑞戈非尼的标准治疗在晚期HCC中仍不令人满意，最近两种PD
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1抑制剂派姆单抗和纳武单抗已获得批准用于索拉非尼服用后出现进展的HCC患者的治疗，为包括HCC在内的多种恶性肿瘤提供了有前景的临床效益。然而，只有约20％的HCC患者对PD
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1阻断表现出明确和持久的反应，因此还亟需寻找更加有效和新靶点的免疫治疗策略。
[0003]跨膜受体信号淋巴细胞激活分子(SLAM)家族，是一组在造血细胞上广泛表达的I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族CD2亚群成员。SLAMF7也称CRACC、CS1、CD319，是SLAM家族第七个成员，在人体多种免疫细胞呈持续性低水平表达，包括NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、部分B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，但在其他组织中不表达。SLAMF7在多发性骨髓瘤(MM)及其恶性浆细胞中持续高表达，已成为辅助诊断MM的新型生物标志物。SLAMF7是“自配体”，能够通过IgV结构域识别另一个细胞上相同的受体分子作为配体；另外，靶向SLAMF7的单克隆抗体，埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)可与IgC2结构域结合，其共同作用是触发胞内段的ITSM招募SLAM适配器蛋白介导人类白细胞的激活信号。有多个研究报道，SLAMF7在多种免疫细胞中可以通过SLAMF7特异性抗体或自配体的结合调控免疫细胞的功能，增强NK细胞、CD8+T细胞的毒性作用。因此，SLAMF7在肿瘤免疫反应中发挥重要作用，是肿瘤免疫治疗的新型靶点。
[0004]目前，针对以SLAMF7作为靶点的免疫治疗药物主要是埃罗妥珠单抗，用于治疗复发或难治性MM。然而，埃罗妥珠单抗在实体肿瘤中未见任何报道，主要原因是实体瘤细胞不表达SLAMF7，单一抗体无法有效同时靶向肿瘤细胞和免疫细胞。近年来，基于抗体结构而进一步开发的双特异性抗体，是目前最有潜在的癌症免疫治疗药物之一。双特异性抗体(BsAbs)是一种可以特异性结合两个抗原或者同一个抗原的两个不同表位的抗体，主要用于治疗肿瘤和自身免疫病。在肿瘤的治疗中，BsAbs是可以双向特异性识别肿瘤抗原和免疫细胞受体(如CD3、CD16)的抗体，促使内源效应T细胞或NK细胞和肿瘤细胞相互作用，进而杀伤肿瘤细胞。BsAbs分子量较小，易于制造，组织穿透增强，但其半衰期短，可导致快速的血液清除以及在靶向部位较差的滞留时间。尽管基于以上的缺点研究者进行了大量的BsAbs格式的改造，但目前还没有明确的首选最佳模式的出现。

技术实现思路

[0005]针对目前现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用，引入了仿生纳米囊泡作为承载双特异性抗体的载体，解决现有双特异性抗体格式的缺陷。
[0006]本专利技术的首要目的在于提供一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡。
[0007]本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：
[0008]一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，由生物细胞构成，细胞表面表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体。
[0009]优选地，所述细胞为HEK293T、HepG2、Huh
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7、Hepa1
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6、SK
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Hep
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1、淋巴细胞中的任意一种。
[0010]更优选地，所述细胞为HEK293T细胞。
[0011]优选地，所述的双特异性抗体的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
[0012]本专利技术的第二个目的在于提供上述表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡的制备方法。
[0013]本专利技术通过以下技术方案实现所述目的：
[0014]一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡的制备方法，包括如下步骤：
[0015]S1、依次将信号肽、靶向SLAMF7的单链抗体、(G4S)2连接肽、靶向GPC3的单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和Myc标签的基因拼接，经酶切后连接到载体，并转化至感受态细胞，培养后进行质粒提取测序，获得含SLAMF7
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GPC3双特异性抗体质粒；
[0016]S2、将步骤S1所得质粒进行慢病毒包装，再将慢病毒质粒系统转染细胞，培养后经抗性筛选得到稳定表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的稳转细胞；
[0017]S3、扩大培养步骤S2所得稳转细胞，收集细胞进行裂解、研磨、梯度离心，沉淀重悬后经挤压形成仿生纳米囊泡。
[0018]优选地，步骤S1所述信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述靶向SLAMF7的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述(G4S)2连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述靶向GPC3的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD8α铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0019]优选地，步骤S2所述慢病毒包装载体为psPAX2和pMD2G质粒。
[0020]本专利技术的第三个目的在于提供上述表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡在制备抗肿瘤药物方面的应用。
[0021]优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、黑色素瘤、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和神经母细胞瘤。
[0022]更优选地，所述肿瘤为肝癌。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0024]本专利技术提供了一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡。一方面，SLAMF7是一种在多种免疫细胞上表达的激活型受体，基于SLAMF7的激活信号可以增强多个免疫细胞的抗肿瘤能力，是肿瘤免疫治疗的新型靶点。GPC3抗原在HCC中特异性高表达，但在正常肝组织、肾和胃腺中均无表达，是HCC特异性靶抗原。因此本专利技术提供的SLAMF7
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GPC3
双特异性抗体能够激活NK细胞、T细胞等多种免疫细胞对表达GPC3靶蛋白的肿瘤细胞具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，其特征在于，由生物细胞构成，细胞表面表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体。2.根据权利要求1所述的一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，其特征在于，所述细胞为HEK293T、HepG2、Huh
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7、Hepa1
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6、SK
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Hep
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1、淋巴细胞中的任意一种。3.根据权利要求1所述的一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，其特征在于，所述细胞为HEK293T。4.根据权利要求1所述的一种表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，其特征在于，所述SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的基因序列如SEQ ID NO.7所示。5.一种权利要求1
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4所述的表达SLAMF7
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GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、依次将信号肽、靶向SLAMF7的单链抗体、(G4S)2连接肽、靶向GPC3的单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和Myc标签的基因拼接，经酶切后连接到载体，并转化至感受态...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄曦，朱漫漫，吴永坚，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：