本发明专利技术公开了TRAF6抑制剂在制备人恶性黑色素瘤治疗药物中的应用,具体涉及肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)抑制剂联合维甲酸在制备人恶性黑色素瘤治疗药物中的应用。本发明专利技术利用RNA干扰技术和Western bolt分析来研究TRAF6在人恶性黑色素瘤中的作用及TRAF6与维甲酸敏感性的关系。通过本发明专利技术的研究可知TRAF6抑制可提高人恶性黑色素瘤对维甲酸的敏感性,开发TRAF6的抑制剂可为人恶性黑色瘤的治疗提供新的策略。治疗提供新的策略。治疗提供新的策略。
【技术实现步骤摘要】
TRAF6抑制剂在制备人恶性黑色素瘤治疗药物中的应用
[0001]本专利技术属于生物医药
,具体涉及肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)抑制剂联合维甲酸在制备人恶性黑色素瘤治疗药物中的应用。
技术介绍
[0002]人恶性黑色素瘤(human malignant melanoma)是一种由皮肤或粘膜上皮黑色素细胞恶性转变而来的恶性肿瘤,占所有皮肤恶性肿瘤的第三位,具有生存率低、易复发、耐药率高等临床特点。近年来,手术切除、常规化疗及生物治疗等一系列治疗策略被应用于人恶性黑色素瘤的治疗中,并取得一定的治疗效果。然而该恶性肿瘤对传统化疗不敏感且恶性黑色素瘤的耐药也是影响治疗效果的最大障碍,故患者的生存率较低。随着恶性黑色素瘤的耐药的分子机制的深入探讨,克服耐药对恶性黑色素瘤的治疗具有重要的研究意义。
[0003]维甲酸(Retinoic acid , RA)来源于维生素A的代谢中间产物,能够调控多重发育过程,是一种非常具有应用前景的抗癌药物。研究表明,维甲酸通过结合细胞核上维甲酸受体(Retinoic acid receptor, RXRs),触发激酶级联反应的细胞核外非转录模式的信号通路,从而激活靶基因的转录和表达,最终发挥抑制增生、诱导分化的活性。近年来维甲酸在治疗人恶性黑色素瘤中表现出良好的抗增殖和抗氧化活性,进一步引发其凋亡。尽管如此,维甲酸不溶于水,遇光、空气、氧化剂不稳定,且外用时有较大的局部刺激性等副作用及诱导凋亡较差,限制了临床应用。同时,许多黑色素瘤细胞对所有反式维甲酸的抗增殖作用都具有抗性。最近有许多分子机制研究挖掘了与黑色素瘤的发生和发展相关的遗传和分子变化,如RAR
‑
β2、 PIN1等基因与维甲酸耐药性密切相关。然而,这些潜在靶点尚未导致有效/治疗性治疗药物的开发。虽然维甲酸作为单一药物对转移性黑色素瘤的治疗并不明显,但它与这些潜在靶点的抑制剂联合使用具有良好的前景。
[0004]肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)是一种适配器蛋白,其通过TRAF结构域和具有E3泛素连接酶活性的RING finger结构域介导广泛的蛋白
‑
蛋白相互作用。TRAF6作为调节蛋白,参与激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、干扰素调节因子通路白细胞介素
‑
1受体(IL
‑
1R)介导的激活NFκB信号通路等。研究表明,TRAF6在原发性和转移性黑色素瘤肿瘤和黑色素瘤细胞系中过表达。同时TRAF6参与调控黑色素瘤的侵袭和转移,这表明TRAF6可能是黑色素瘤治疗或化疗预防的潜在靶点。因此,抑制TRAF6或与其他方法联合应用的潜在治疗效果值得研究。
[0005]目前,关于TRAF6在维甲酸治疗人恶性黑色素瘤中的研究尚未见报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的是提供肿瘤坏死因子受体相关因子6抑制剂联合维甲酸在制备人恶性黑色素瘤治疗药物中的应用。
[0007]本专利技术利用RNA干扰技术和Western bolt 分析来研究TRAF6在人恶性黑色素瘤中的作用及TRAF6与维甲酸敏感性的关系。首先,敲低TRAF6后显著降低了维甲酸对A357细胞
的IC
50
和Mewo细胞的IC
50
,表明抑制TRAF6提高了人恶性黑色素瘤细胞对维甲酸敏感性;之后进一步考察了TRAF6的抑制对人恶性黑色素瘤细胞Mewo在维甲酸的处理下细胞克隆形成的影响;最后研究了TRAF6基因敲低与维甲酸联用对于促凋亡因子和抗凋亡因子的影响。
[0008]经过上述研究可知,TRAF6抑制可提高人恶性黑色素瘤对维甲酸的敏感性,开发TRAF6的抑制剂可为人恶性黑色瘤的治疗提供新的策略。
附图说明
[0009]图1为敲低TRAF6后人恶性黑色素瘤细胞系对维甲酸治疗的敏感性提高的结果。A为不同浓度的视黄酸处理转染阴性对照(siNEG)或靶向TRAF6的siRNA(siTRAF6)的A357细胞结果;B为不同浓度的视黄酸处理转染阴性对照(siNEG)或靶向TRAF6的siRNA(siTRAF6)的MeWo细胞结果。
[0010]图2为敲低TRAF6抑制人恶性黑色素瘤细胞增殖的结果。A为Mewo细胞在siNEG或siTRAF6转染后,经8 μM维甲酸处理后的细胞克隆形成情况;B为GraphPad Prism 8.2.0定量分析不同处理组细胞克隆形成的结果,所有数据均为三次独立重复实验的数据,用三次测量的平均值
±
标准差表示,** p<0.01、*** p<0.001。
[0011]图3为MeWo细胞在维甲酸(RA)处理前后TRAF6敲低对凋亡相关因子的蛋白水平变化结果。
具体实施方式
[0012]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明,但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下,对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
[0013]实施例11. 细胞培养两种不同的人恶性黑色素瘤细胞株A357和MeWo购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC),上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10% FBS,1% 青霉素
‑
链霉素)于5% CO2的37
°
C恒温细胞专用培养箱培养,实验用细胞培养时间不超过三个月,每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10% DMSO的FBS冻存。
[0014]2. 细胞转染前一天开始在60 mm皿中培养A357和MeWo细胞,使每皿细胞预计在普板后第二天的细胞汇聚度为70%
‑
80%。在500 μL Opti
‑
MEM reduced serum medium中加入5 μM siGENONE SMARTpool TRAF4 siRNA(M
‑
004712
‑
00
‑
000,Horizon Discovery)或siGENOME non
‑
targeting Control siRNA(D
‑
001206
‑
13
‑
5,Horizon Discovery),轻轻混匀,静置5 min。在500 μL Opti
‑
MEM reduced serum medium中加入10 μL 转染试剂Lipofectamine RNAiMax,轻轻混匀,静置5 min。将上述溶液轻轻混匀,室温孵育15 min,即获得转染溶液。将此混合溶液滴加至分别培养A357和MeWo细胞的60 mm细胞培养皿中,轻轻混匀。转染6 h后,更换新鲜完全培养基,置于5% CO2的37
°
C恒温细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.肿瘤坏死因子受体相关因子6抑制剂联合维甲酸在制备肿瘤治疗药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述肿瘤为人恶性黑色素瘤。3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述肿瘤坏死因子受体相关因子6抑制剂为siRNA。4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述siRNA序列如下:(1)5
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【专利技术属性】
技术研发人员:顾亚云,曾旭辉,
申请(专利权)人:南通大学,
类型:发明
国别省市:
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