结核分枝杆菌融合蛋白BfrB-GrpE及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了结核分枝杆菌融合蛋白BfrB

【技术实现步骤摘要】
结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE及制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药工程
，尤其是应用基因工程的方法进行新型结核亚单位疫苗的构建。

技术介绍

[0002]结核病是由结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis,M.Tuberculosis)感染引起，是感染单一病原菌导致死亡人数最多的传染疾病之一。目前，卡介苗(Bacille Calmette
‑
Gu
é
rin，BCG)是唯一用于临床预防结核病疫苗，但其对成人结核病的保护效果不佳。大量研究表明结核亚单位疫苗可提供长期的免疫保护效果且安全性好，因而具有较好的应用开发前景。结核分枝杆菌感染机体后，在宿主体内存在不同的代谢状态，如复苏期(resuscitation)、复制期(replication)和休眠期(dormancy)多个阶段，且不同代谢状态在一定条件下可以相互转换。因此，新型结核亚单位疫苗应该包含有不同代谢阶段的免疫优势抗原，构成多阶段疫苗，可有效提高抗结核保护效果。
[0003]结核亚单位疫苗是结核分枝杆菌中的一些具有免疫活性成分物质(如蛋白质、多肽、糖脂等)，相比于活疫苗其成分明确、成本低、产量高、安全性好、制备较容易、质量控制好以及通过接种疫苗可以增强T细胞的免疫记忆。与全细胞疫苗相比，亚单位疫苗靶向少数选定抗原，通常为六种甚至更少。到目前为止，只有少数被鉴定为有希望的结核病亚单位疫苗候选抗原。在各种动物模型中，主要根据抗原性、免疫原性和抗感染保护性来选择合适的抗原。由于结核病的发病机制复杂，上述方法可能具有局限性。因此，开发蛋白亚单位疫苗主要的挑战是确定此类疫苗中包含抗原的种类及数量。一些研究人员根据结核分枝杆菌感染机体的代谢状态，筛选不同生长阶段的免疫优势抗原纳入候选疫苗。此外，与卡介苗相比，结核病亚单位疫苗面临着一些不可避免的挑战，包括免疫原性差、免疫记忆持续时间较短，因此需要与佐剂联合使用才能产生较好的免疫保护效果。
[0004]将结核分枝杆菌休眠期抗原HspX和Rv2626与复制期免疫优势抗原ESAT
‑
6、Mtb8.4、Mtb10.4、Ag85B融合，构建的MH(Mtb10.4
‑
HspX)、LT69(ESAT
‑6‑
Ag85B
‑
MPT64190
‑
198
‑
Mtb8.4
‑
HspX)和LT70(ESAT
‑6‑
Ag85B
‑
MPT64190
–
198
‑
Mtb8.4
‑
Rv2626c)等多阶段疫苗显示出比单一时期抗原构建疫苗具有更好的抗结核分枝杆菌毒株H37Rv感染保护效果。专利技术人通过大量文献查阅及计算机对抗原表位的预测筛选出免疫优势抗原—BfrB和GrpE。结核分枝杆菌BfrB(Rv3841)是铁储存蛋白，具有较强的免疫原性，在小鼠体内可以诱导同结核分枝杆菌经典抗原Ag85B相当的免疫应答；GrpE(Rv3051)是HSP70复合蛋白的组分之一，具有较强的免疫原性，在小鼠体内诱导的免疫记忆反应与ESAT6相当，单个抗原对抗结核分枝杆菌毒株的能力与结核传统疫苗BCG相当。因此，将BfrB和GrpE抗原联合构建无标签融合蛋白BfrB
‑
GrpE(简称BG)，旨在开发更有效的多阶段亚单位疫苗。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种融合了结核分枝杆菌复制和休眠期免疫优势抗原BfrB和休眠
期免疫优势抗原GrpE的新型融合蛋白BG，并提出了该融合蛋白的构建表达纯化方法。
[0006]本专利技术所提供的新型融合蛋白BG和佐剂进行联合构建结核亚单位疫苗，该疫苗诱导了偏向Th1型细胞免疫反应，后期有望成为更为有效的结核病新型候选疫苗。
[0007]本专利技术采用以下技术方案：结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE，由结核分枝杆菌复制和休眠期免疫优势抗原BfrB和休眠期免疫优势抗原GrpE联合构建而成，氨基酸序列为：
[0008]MTEYEGPKTKFHALMQEQIHNEFTAAQQYVAIAVYFDSEDLPQLAKHFYSQAVEERNHAMMLVQHLLDRDLRVEIPGVDTVRNQFDRPREALALALDQERTVTDQVGRLTAVARDEGDFLGEQFMQWFLQEQIEEVALMATLVRVADRAGANLFELENFVAREVDVAPAASGAPHAAGGRLGGGGSGGGGSGGGGSVTDGNQKPDGNSGEQVTVTDKRRIDPETGEVRHVPPGDMPGGTAAADAAHTEDKVAELTADLQRVQADFANYRKRALRDQQAAADRAKASVVSQLLGVLDDLERARKHGDLESGPLKSVADKLDSALTGLGLVAFGAEGEDFDPVLHEAVQHEGDGGQGSKPVIGTVMRQGYQLGEQVLRHALVGVVDTVVVDAAELESVDDGTAVADTAENDQADQGNSADTSGEQAESEPSGS。
[0009]结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE的制备方法，包括以下步骤：一、融合蛋白BG的构建，二、融合蛋白BG小批量表达，三、融合蛋白BG发酵表达，四、融合蛋白BG的工业化发酵，五、融合蛋白BG的纯化。
[0010]可选地，所述步骤一具体为：设计BfrB
‑
GrpE融合基因，两个基因之间加linker，翻译成氨基酸序列为：
[0011]MTEYEGPKTKFHALMQEQIHNEFTAAQQYVAIAVYFDSEDLPQLAKHFYSQAVEERNHAMMLVQHLLDRDLRVEIPGVDTVRNQFDRPREALALALDQERTVTDQVGRLTAVARDEGDFLGEQFMQWFLQEQIEEVALMATLVRVADRAGANLFELENFVAREVDVAPAASGAPHAAGGRLGGGGSGGGGSGGGGSVTDGNQKPDGNSGEQVTVTDKRRIDPETGEVRHVPPGDMPGGTAAADAAHTEDKVAELTADLQRVQADFANYRKRALRDQQAAADRAKASVVSQLLGVLDDLERARKHGDLESGPLKSVADKLDSALTGLGLVAFGAEGEDFDPVLHEAVQHEGDGGQGSKPVIGTVMRQGYQLGEQVLRHALVGVVDTVVVDAAELESVDDGTAVADTAENDQADQGNSADTSGEQAESEPSGS*
[0012]下划线为linker
[0013]将pET30a(+)
‑
BfrB
‑
GrpE基因优化并合成，得到pET30a(+)
‑
BfrB
‑
GrpE载体。
[0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE，其特征在于：由结核分枝杆菌复制和休眠期免疫优势抗原BfrB和休眠期免疫优势抗原GrpE联合构建而成，氨基酸序列为：MTEYEGPKTKFHALMQEQIHNEFTAAQQYVAIAVYFDSEDLPQLAKHFYSQAVEERNHAMMLVQHLLDRDLRVEIPGVDTVRNQFDRPREALALALDQERTVTDQVGRLTAVARDEGDFLGEQFMQWFLQEQIEEVALMATLVRVADRAGANLFELENFVAREVDVAPAASGAPHAAGGRLGGGGSGGGGSGGGGSVTDGNQKPDGNSGEQVTVTDKRRIDPETGEVRHVPPGDMPGGTAAADAAHTEDKVAELTADLQRVQADFANYRKRALRDQQAAADRAKASVVSQLLGVLDDLERARKHGDLESGPLKSVADKLDSALTGLGLVAFGAEGEDFDPVLHEAVQHEGDGGQGSKPVIGTVMRQGYQLGEQVLRHALVGVVDTVVVDAAELESVDDGTAVADTAENDQADQGNSADTSGEQAESEPSGS。2.结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：一、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE的构建二、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE小批量表达三、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE发酵表达四、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE的工业化发酵五、结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE的纯化。3.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE的制备方法，其特征在于：所述步骤一具体为：设计BfrB
‑
GrpE融合基因，两个基因之间加linker，翻译成氨基酸序列为：MTEYEGPKTKFHALMQEQIHNEFTAAQQYVAIAVYFDSEDLPQLAKHFYSQAVEERNHAMMLVQHLLDRDLRVEIPGVDTVRNQFDRPREALALALDQERTVTDQVGRLTAVARDEGDFLGEQFMQWFLQEQIEEVALMATLVRVADRAGANLFELENFVAREVDVAPAASGAPHAAGGRLGGGGSGGGGSGGGGSVTDGNQKPDGNSGEQVTVTDKRRIDPETGEVRHVPPGDMPGGTAAADAAHTEDKVAELTADLQRVQADFANYRKRALRDQQAAADRAKASVVSQLLGVLDDLERARKHGDLESGPLKSVADKLDSALTGLGLVAFGAEGEDFDPVLHEAVQHEGDGGQGSKPVIGTVMRQGYQLGEQVLRHALVGVVDTVVVDAAELESVDDGTAVADTAENDQADQGNSADTSGEQAESEPSGS*下划线为linker将pET30a(+)
‑
BfrB
‑
GrpE基因优化并合成，得到pET30a(+)
‑
BfrB
‑
GrpE载体。4.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌融合蛋白BfrB
‑
GrpE的制备方法，其特征在于：所述步骤二具体为：将构建成功的pET30a(+)
‑
BfrB
‑
GrpE载体转化入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)
‑
pLySs感受态细胞中用...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹倩倩，牛红霞，祝秉东，王燕琴，雒艳萍，何朴，王娟，米友军，李菲，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：