自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。本发明专利技术以C57BL/6J小鼠与小鼠脑血管内皮细胞（bEnd.3）为研究对象，构建脑缺血再灌注损伤模型，通过β

【技术实现步骤摘要】
自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老的药物中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。

技术介绍

[0002]脑梗死是指由于颅内血管狭窄导致血液循环障碍，继而引发神经系统功能紊乱的多发性疾病。因其高发病率，高致残率，高死亡率及低预后率特点，给社会与家庭带来极大的负担，目前仍无有效的防治方法。衰老是机体随着年龄或者病程发展，出现生理性或者病理性功能衰退的病变过程。脑梗死后脑细胞衰老是指神经血管单元因缺血缺氧损伤，导致大量的细胞器或蛋白发生病变，失去原有功能的病理性衰退过程，它是导致脑梗后认知与运动功能障碍的主要原因之一，抑制衰老有助于改善脑梗患者预后，但目前缺乏有效的干预手段。衰老的机制异常复杂，目前尚无明确的分子机制及干预靶点，但及时清除病理性损伤的细胞器或蛋白，降低继发性损伤，普遍认为是抑制衰老的有效途径。
[0003]自噬是指自噬体吞噬受损的细胞器或蛋白，并在溶酶体的作用下降解所包裹的物质，以实现细胞本身的代谢所需物质与能量再利用的过程。自噬作为“细胞内免疫系统”，是真核细胞为对抗逆境而形成的内源性防御性机制。在缺血缺氧病理条件下，细胞内受损的细胞器（如线粒体，内质网等）或聚集失活的蛋白，可破坏细胞内电离平衡，产生氧自由基等细胞毒素，从而导致细胞衰老。自噬能否及时清除这些受损的细胞器或聚集的蛋白，将决定细胞是否发生衰老的关键过程。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提出一种自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。
[0005]本专利技术的目的将通过以下技术方案得以实现：本专利技术一方面提供了自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。
[0006]进一步的，所述自噬调节剂包括自噬增强剂雷帕霉素和自噬抑制剂氯喹。
[0007]进一步的，所述自噬增强剂雷帕霉素抑制脑梗死后脑细胞衰老，所述自噬抑制剂氯喹促进脑梗死后脑细胞衰老。
[0008]进一步的，所述自噬调节剂对小鼠的实验给药方式为尾静脉注射，连续7天，每天注射一次，所述雷帕霉素的尾静脉注射用量为0.75 mg/kg/d，注射体积为0.20
±
0.02 ml；所述氯喹的尾静脉注射用量为5 mg/kg/d，注射体积为0.20
±
0.02 ml。
[0009]进一步的，所述脑细胞衰老的检测方法为β
‑
半乳糖苷酶染色法。
[0010]本专利技术的突出效果为：本专利技术以C57BL/6J小鼠与小鼠脑血管内皮细胞（bEnd.3）为研究对象，构建脑缺血再灌注损伤模型，通过β
‑
半乳糖苷酶染色检测细胞衰老，以及免疫荧光，蛋白免疫印迹分析自噬相关蛋白LC3B表达水平，证实在脑梗周边区存在细胞衰老与自噬。结果证实衰老与自
噬可能是参与脑梗死后继发性损伤的靶点。
[0011]通过使用自噬调节剂增强或抑制自噬，发现自噬能抑制脑缺血再灌注后衰老过程。本专利技术证实自噬调节剂通过调控自噬清除受损蛋白或细胞器，具有延缓衰老的功能，是制备脑梗后抗衰老药物有效辅助成分。
[0012]以下便结合实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步的详述，以使本专利技术技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
[0013]图1A为本专利技术实施例1的C57BL/6J年轻雄性小鼠（4
‑
6周）与老年雄性小鼠（18
‑
20周）在脑缺血再灌注后梗死周边区脑组织衰老面积的结果图；图1B为本专利技术实施例1的图1A的统计结果图；图1C为本专利技术实施例1的小鼠脑微血管内皮细胞在不同OGD/R的时间阶段内衰老细胞数量的结果图；图1D为本专利技术实施例1的图1C的统计结果图；图2A为本专利技术实施例2的年轻雄性小鼠（4
‑
6周）脑缺血再灌注后梗死周边区自噬相关蛋白LC3B的表达水平的结果图；图2B为本专利技术实施例2的图2A的统计结果图；图2C为本专利技术实施例2的老年雄性小鼠（18
‑
20周）脑缺血再灌注后梗死周边区自噬相关蛋白LC3B的表达水平的结果图；图2D为本专利技术实施例2的图2C的统计结果图；图3A为本专利技术实施例2的免疫荧光方法检测bEnd.3细胞在氧糖剥夺6 h恢复氧糖6 h后自噬相关蛋白LC3B的表达水平的结果图；图3B为本专利技术实施例2的图3A的统计结果图；图4A为本专利技术实施例3的自噬增强剂与自噬抑制剂对年轻雄性小鼠（4
‑
6周）与老年雄性小鼠（18
‑
20周）脑缺血再灌注后梗死周边区衰老面积的结果图；图4B为本专利技术实施例3的图4A的统计结果图；图4C为本专利技术实施例3的自噬调节剂对bEnd.3细胞OGD/R后衰老细胞数量的结果图；图4D为本专利技术实施例3的图4C的统计结果图。
实施方式
[0014]为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限本专利技术。
[0015]本专利技术上下文中所使用的试剂，均通过市售获得。本专利技术所使用的实验方法均为本领域的常规方法和技术。
[0016]实施例1 脑缺血再灌注后梗死周边区衰老水平（1）MCAO/R实验选择体重为25
±
2 g的年轻（4
‑
6周）与老年（18
‑
20周）C57BL/6J雄性小鼠，分为
Sham组与MCAO/R组，每组各6只。MCAO/R组采用小鼠脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R，闭塞1.5 h，再灌注24 h）方法，构建小鼠脑梗死模型。
[0017]采用异氟烷进行气体麻醉。将麻醉后的小鼠仰卧位固定于操作台上，并进行颈部脱毛。碘酒消毒皮肤后，在颈部正中处从头到尾方向切3 cm切口，用镊子分离皮下各层结缔组织与肌肉组织，暴露右侧粗大、在搏动的粉红的颈总动脉（Common carotid artery，CCA）。分离出CCA后，向上分离（远心端）分离进外颈动脉（external carotid artery，ECA），在CCA与ECA交叉处用3
‑
0线结扎CCA。在ECA远心端与近心端用6
‑
0线进行结扎。在ECA两线之间切个小口，将栓线从上往下插入血管内（有远心端到近心端），然后用5
‑
0线绑住栓线。解开ECA近心端与远心端的6
‑
0线，然后将线栓经CCA与ECA交叉处进入内颈动脉（internal carotid artery，ICA）。注意避免进入翼腭动脉。当栓线进入ICA 大概1 cm左右后，感觉有阻力时则为阻断大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）入口。最后解开CCA远心端的3
‑
0线。将小鼠放回温室饲养1.5 h，然后拔出栓线进行再灌注24 h。再灌注后将小鼠进行Longa评分，具体评分标准如下：0分 神经功能无缺损，运动弄能正常；1分 提尾时左前肢前伸困难本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.自噬调节剂在制备治疗脑梗死后脑细胞衰老药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述自噬调节剂包括自噬增强剂雷帕霉素和自噬抑制剂氯喹。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述自噬增强剂雷帕霉素抑制脑梗死后脑细胞衰老，所述自噬抑制剂氯喹促进脑梗死后脑细胞衰老。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨振国，徐安定，李克深，逯丹，李玉峰，臧建坤，文雪怡，黄成，
申请(专利权)人：暨南大学附属第一医院广州华侨医院，
类型：发明
国别省市：