一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是涉及一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用。组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，将其扩增后通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；然后将重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coli DE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD

【技术实现步骤摘要】
一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用。

技术介绍

[0002]启动子是RNA聚合酶和转录因子结合的部位，通常位于基因的上游区域，在调控合成代谢中起着重要作用，主要分为RNA聚合酶Ⅰ，RNA聚合酶Ⅱ，RNA聚合酶Ⅲ三类，在细胞中常规基因的启动子，几乎都是Ⅱ型启动子，此类启动子的特点是转录长度不限。Ⅱ型启动子包括了组成型启动子和诱导型启动子。诱导型启动子需要加入特定的物质才能激发或者抑制其活性；而表达系统中，运用最多的则是组成型启动子，这类启动子在绝大部分细胞里面都能维持一定的表达活性，但是不同的组成型启动子在不同的细胞中却有高低表达之分。
[0003]南北极有着世界上最特殊的地理和气候条件。生存在这种极端环境里的微生物相应具备了独特的生物适应机制，它们往往具备嗜寒、耐盐、耐压等特性，具有重要的科学价值。极地微生物资源的开发利用已显示出广阔的应用前景，从极地微生物中已获得了大量优良的功能基因，而对组成型启动子的报道却很少，其数量远远不能匹配基因数量的增长。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用。组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，将其扩增后通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；然后将重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coli DE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD
600
，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种组成型启动子P256，所述组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，包括以下步骤：
[0008](1)利用引物对通过PCR扩增北极细菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308基因组中组成型启动子P256，得到扩增产物；
[0009](2)将步骤(1)扩增得到的扩增产物通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；
[0010](3)将步骤(2)得到的重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coli DE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD
600
，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。
[0011]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，所述引物对为P
‑
1和P
‑
2；其中P
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，PCR的扩增过程中，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸5min。
[0013]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(2)中，酶切后的pRU1701质粒为经SpeⅠ酶切后的pRU1701质粒。
[0014]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(3)中，所述LB培养基中含有庆大霉素。
[0015]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(3)中，使用Fluoroskan Ascent FL全自动荧光化学发光分析仪测量样品的荧光值；使用光吸收酶标仪测量样品的OD
600
。
[0016]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(3)中，荧光值检测时，激发波长为485nm，发射波长为538nm。
[0017]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(3)中，荧光值除以对应的OD
600
为单位荧光强度，当重组质粒的单位荧光强度高于空白载体pRU1701质粒的单位荧光强度时，则证明组成型启动子P256活性高，反之，证明组成型启动子P256活性低。
[0018]本专利技术的第三个目的是提供一种组成型启动子P256的应用，所述组成型启动子P256用于应用到其他不同种原核细菌以提高外源蛋白表达量。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020]本专利技术鉴定出了北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308基因组中一种组成型启动子P256，通过构建重组载体，该启动子在大肠杆菌中仍然保持活性，且不需要诱导物，是一种具有普遍活性的组成型启动子，有潜力应用到其他不同种的原核细菌中，包括特殊的极端环境微生物；进一步的，组成型启动子P256能够用于提高外源蛋白表达量。
附图说明
[0021]图1为实施例1构建得到的重组质粒的示意图；
[0022]图2为实施例1构建得到的重组质粒和空白质粒在不同时间的GFP单位荧光强度；其中，***代表P<0.001。
具体实施方式
[0023]本专利技术提供一种组成型启动子P256，所述组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0024]本专利技术提供一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，包括以下步骤：
[0025](1)利用引物对通过PCR扩增北极细菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308基因组中组成型启动子P256，得到扩增产物；
[0026](2)将步骤(1)扩增得到的扩增产物通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；
[0027](3)将步骤(2)得到的重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coli DE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD
600
，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。
[0028]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，所述引物对为P
‑
1和P
‑
2；其中P
‑
1的核苷
酸序列如SEQ ID NO.2所示，P
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0029]在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，PCR的扩增过程中，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30se本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组成型启动子P256，其特征在于，所述组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种如权利要求1所述的组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用引物对通过PCR扩增北极细菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308基因组中组成型启动子P256，得到扩增产物；(2)将步骤(1)扩增得到的扩增产物通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；(3)将步骤(2)得到的重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coliDE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD
600
，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。3.根据权利要求2所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物对为P
‑
1和P
‑
2；其中P
‑
1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P
‑
2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求2所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR的扩增过程...

【专利技术属性】
技术研发人员：段泽东，陈波，廖丽，文姣，
申请(专利权)人：中国极地研究中心中国极地研究所，
类型：发明
国别省市：