病毒核酸检测试剂、试剂盒、制备方法及其应用技术

本申请提供的病毒核酸检测试剂的制备方法，ASFV扩增子与crRNA杂交后，Cas12a切割MB

【技术实现步骤摘要】
病毒核酸检测试剂、试剂盒、制备方法及其应用


[0001]本申请涉及生物试剂
，特别涉及一种病毒核酸检测试剂、制备方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002][0003]ASFV的检测方法一般可以分为两大类：1)免疫检测方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)和横向流动法(LFA)；2)核酸分子检测方法，如聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)等。核酸检测因其具有良好的灵敏度和准确性，一直被公认为是基因检测的金标准。然而，PCR需要热循环仪器和熟练的操作人员，这使得PCR很难在资源有限的情况下进行。等温扩增不受这些限制，因此等温扩增已成为一种具有良好前景的PCR替代检测方法。其中RPA的灵敏度略低于PCR，LAMP的灵敏度较好，但需要复杂的引物设计。最近，RPA结合CRISPR技术被广泛用于基因诊断工具开发中，以进一步提高检测灵敏度。在CRISPR/Cas系统中，一些CRISPR相关蛋白(Cas)，包括Cas12a、Cas13a和Cas14，在识别目标序列被激活后表现出非特异性的的反式切割活性。该特性可用于病原体基因序列的特异性检测，并促进快速、高灵敏度和低成本的疾病早期诊断。
[0004]为了有效避免检测中的假阳性，已经开发了多种双模式传感策略，包括SERS(表面增强拉曼散射)/荧光、SERS/比色法和荧光/比色法。荧光/比色传感技术结合了荧光检测灵敏度高和比色检测范围宽的优点，除此之外该策略还可以避免荧光基质对荧光的干扰和有色基质对比色法的干扰，并且在肉眼检测中显示出良好的潜力和可操作性。目前开发的基于比色法的双模式策略主要依赖于金属纳米颗粒聚集引起的比色变化，如金或银纳米颗粒，但金属纳米颗粒可能出现非特异性聚集，从而影响检测结果准确性。

技术实现思路

[0005]鉴于此，有必要针对现有技术中存在的缺陷提供一种具有良好的特异性和准确性，的病毒核酸检测试剂、制备方法、试剂盒及其应用。
[0006]为解决上述问题，本申请采用下述技术方案：
[0007]本申请的目的之一，提供了一种病毒核酸检测试剂的制备方法，包括下述步骤：
[0008]合成Biotin
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ssDNA
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ALP；
[0009]根据所述Biotin
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ssDNA
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ALP合成MB
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ssDNA
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ALP；
[0010]反式切割所述MB
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ssDNA
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ALP的活性；
[0011]将经反式切割后的所述MB
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ssDNA
‑
ALP释放ALP；
[0012]所述ALP催化pNPP水解生成pNP；
[0013]在所述pNP中加入CdZnSe量子点。
[0014]在其中一些实施例中，在合成Biotin
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ssDNA
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ALP的步骤中，具体包括下述步骤：
[0015]Biotin
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ssDNA
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N3与DBCO
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ALP通过化学点击反应合Biotin
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ssDNA
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ALP。
[0016]在其中一些实施例中，在根据所述Biotin
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ssDNA
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ALP合成MB
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ssDNA
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ALP的步骤中，具体包括下述步骤：
[0017]将合成的Biotin
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ssDNA
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ALP与链霉亲和素修饰磁珠结合合成MB
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ssDNA
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ALP。
[0018]在其中一些实施例中，在反式切割所述MB
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ssDNA
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ALP的活性的步骤中，具体包括下述步骤：
[0019]利用RPA扩增ASFV双链DNA模板产生扩增子，所述扩增子与crRNA杂交激活Cas12反式切割MB
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ssDNA
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ALP的活性。
[0020]本申请的目的之二，提供了一种病毒核酸检测试剂，由上述所述的制备方法制备得到。
[0021]本申请的目的之三，提供了一种病毒核酸检测试剂盒，包括所述的病毒核酸检测试剂。
[0022]本申请的目的之四，提供了一种病毒核酸检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：将待检测液体添加至所述病毒核酸检测试剂盒内，所述病毒核酸检测试剂盒内的检测试剂的吸收强度或荧光强度与所述待检测液体中ASFV基因浓度呈线性关系。
[0023]本申请的目的之五，提供了一种所述的病毒核酸检测试剂盒用于检测ASFV基因或区分crRNA中的单碱基突变以及检测血清中的病毒DNA。
[0024]本申请采用上述技术方案，其有益效果如下：
[0025]本申请提供的病毒核酸检测试剂的制备方法，ASFV扩增子与crRNA杂交后，Cas12a切割MB
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ssDNA
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ALP释放ALP，释放的ALP催化pNPP水解为pNP，从而产生比色信号，而pNP对CdZnSe量子点的内滤作用改变了荧光信号，采用这种双模式方法检测ASFV基因，吸收强度或荧光强度与ASFV基因浓度呈良好的线性关系，检出限为单拷贝。此外，该方法可对单拷贝ASFV基因进行肉眼检测，检测灵敏度高于qPCR。最后，该方法还能有效区分crRNA中的单碱基突变，对血清中的病毒DNA有较好的检测效果。因此，该方法具有良好的敏感性和特异性，在病毒感染诊断中具有很高的应用潜力。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]图1为本申请实施例提供的病毒核酸检测试剂的制备方法的步骤流程图。
[0028]图1A为申请本实施例提供的病毒核酸检测试剂的原理图。
[0029]图1B为申请本实施例提供的制备、表征biotin
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ssDNA
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ALP与MB
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ssDNA
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ALP。
[0030]图2为申请本实施例提供的电泳分析ASFV基因的RPA扩增产物以及CRISPR/Cas12a系统顺式切割活性示意图。
[0031]图3为申请本实施例提供的基于RPA
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CRISPR/Cas12a的比色
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荧光双模式检测ASFV基因示意图。
[0032]图4为申请本实施例提供的选择性与复杂样本检测示意图。
[0033]图5为申请本实施例提供的RPA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病毒核酸检测试剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：合成Biotin
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ssDNA
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ALP；根据所述Biotin
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ssDNA
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ALP合成MB
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ssDNA
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ALP；反式切割所述MB
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ssDNA
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ALP的活性；将经反式切割后的所述MB
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ssDNA
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ALP释放ALP；所述ALP催化pNPP水解生成pNP；在所述pNP中加入CdZnSe量子点。2.如权利要求1所述的病毒核酸检测试剂的制备方法，其特征在于，在合成Biotin
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ssDNA
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ALP的步骤中，具体包括下述步骤：Biotin
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ssDNA
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N3与DBCO
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ALP通过化学点击反应合Biotin
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ssDNA
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ALP。3.如权利要求1或2所述的病毒核酸检测试剂的制备方法，其特征在于，在根据所述Biotin
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ssDNA
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ALP合...

【专利技术属性】
技术研发人员：马英新，毛国斌，戴俊彪，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：