用于RNA病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于RNA病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法和应用，属于病毒检测技术领域。包括DNA片段合成，PCR扩增，体外RNA转录，RNA混合，RNA冻干，RNA拷贝数的标定。通过该制备方法能得到稳定的病毒RNA全长基因组质控品，可解决市面上各家试剂盒标准不统一，无明确拷贝数质控品，运输不稳定等难题。该质控品常温储存，加水复溶后即可使用；具有明确的拷贝数，可直接进行稀释成不同浓度的质控品，来很好的验证各家试剂盒的检测极限，极大的减少了临床上假阳性的可能性。该工艺制备的质控品能很好的应用于市面上所有的基于PCR或NGS平台的病毒核酸类检测试剂盒的性能评估和临床诊断，具有很好的应用价值。具有很好的应用价值。具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
用于RNA病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种用于RNA病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]由于相关肺炎感染事件屡次发生，国内多家检测公司相继推出相关病毒核酸检测试剂盒，这些试剂盒主要是基于PCR或者q
‑
PCR的方法来对病毒的核酸进行检测，随后也相继有基于NGS方法的试剂盒正在加紧研发中。虽然这些试剂盒的问世极大的满足了市场上关于病毒核酸快速检测的需求。但是由于试剂盒的检测限没有明确拷贝数的RNA物质来做参照，难以确认，检测结果为假阴性的新闻不断被报道，导致一些病毒携带者又造成了二次传播，极大的增加了防控疫情的难度。
[0003]由于各家试剂盒所检测的病毒核酸片段不一致，市面上很难有统一的质控品来对所有的试剂盒来进行质量控制。
[0004]相关病毒的遗传物质为RNA，在体外很难长时间储存，因此核酸检测试剂盒在运输以及储存的过程中，很难有一个稳定的RNA质控品来对其进行性能监测，因此需要一种稳定的RNA质控品来对其相应的试剂盒性能进行验证，对试剂盒的质量进行控制。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术存在的核酸检测试剂盒中缺乏统一、稳定、可重复生产且安全性高的质控品的技术问题，本专利技术目的在于提供一种用于RNA病毒检测试剂盒的质控品及其制备方法和应用。
[0006]本专利技术所采用的技术方案为：一种用于RNA病毒检测试剂盒的质控品的制备方法，所述制备方法包括：<br/>[0007]获取至少一个待测病毒的RNA基因组序列，并生成对应的互补序列；
[0008]将互补序列进行分段、合成、扩增和转录本的纯化处理；
[0009]对处理后的每个核苷酸片段设计引物探针并确定RNA转录本的拷贝数；
[0010]将上述每个RNA转录本混合后，加入保存稳定剂、冻干，获得RNA干粉；
[0011]将所述RNA干粉中加水复溶、标定拷贝数，确定RNA质控品参数，获得所需RNA质控品。
[0012]上述待测病毒均是指遗传物质为RNA的病毒，例如：新型冠状病毒(COVID
‑
19)，艾滋病病毒，丙型肝炎病毒，乙型脑炎病毒，全部流感病毒,埃博拉病毒(Ebola virus)等。
[0013]上述将每个RNA转录本混合，即是指将每个大小不同的核苷酸片段进行处理后的RNA转录本片段混合。通过上述方式混合制备成病毒基因组全长RNA质控品，这些片段既可以来源于同一种病毒，也可以来源于不同的病毒。如果片段来源于不同的病毒，制备成的RNA质控品就可以同时应用于多种病毒的检测试剂盒。
[0014]作为优选地，对所述互补序列进行分段处理中，每个片段的大小不少于3000bp；
[0015]优选地，所述互补序列每个片段之间有重叠区域，所述重叠区域大小为100
‑
500bp。
[0016]具体的，上述可根据RNA基因组全长设计合成片段的数目，需合成片段的数目约为基因组全长/3000。
[0017]作为优选地，对所述互补序列进行合成处理包括：采用RNA聚合酶，以DNA双链为模板，体外合成RNA。
[0018]作为优选地，在对所述互补序列进行合成处理之后、扩增处理之前，还包括：采用DNA酶消化反应液，去除DNA模板以及DNA酶的灭活处理；
[0019]所述扩增处理包括：扩增引物的设计时，在正向引物处连接RNA转录酶结合序列。
[0020]上述RNA聚合酶主要指商业化的体外转录酶，如Ambion
TM T7 RNA Po lymerase，Ambion
TM SP6 RNA Po lymerase，T3 RNA Po lymerase等RNA转录酶。当使用Ambion
TM T7 RNA Po lymerase时，优选地体外转录的时间为30
‑
60min。
[0021]上述DNA酶主要指商业化的TURBO
TM
DNase和Ambion
TM
DNase I，当使用TURBO
TM
DNase时，优选地DNA消化时间为15min，最佳温度为37℃。
[0022]上述RNA转录本的纯化可以采用酚氯仿提取法，层析柱分离法或凝胶电泳分离法。
[0023]作为优选地，所述引物探针标记的荧光基团为FAM或6
‑
FAM；
[0024]所述荧光猝灭基团为BHQ1，TAMRA或MGB中的任意一种。
[0025]作为优选地，所述确定RNA转录本的拷贝数的方法为RT
‑
ddPCR法。
[0026]上述RT
‑
ddPCR采用的是伯乐的QX200 Droplet Digital PCR和One
‑
Step RT
‑
ddPCR Advanced Kit for Probes试剂组合。
[0027]作为优选地，所述冻干条件为：在2
‑
8℃、30
‑
50Pa下，处理1
‑
1.2h。
[0028]一种RNA病毒检测试剂盒质控品，由所述的用于RNA病毒检测试剂盒的质控品的制备方法获得。
[0029]一种RNA病毒检测试剂盒质控品在病毒检测试剂盒非诊断目的检测中的应用。
[0030]一种RNA病毒检测试剂盒质控品在制备实验室日常质控品中的应用。
[0031]上述该RNA病毒检测试剂盒质控品还适用于病毒核酸诊断试剂盒性能评价中的应用，尤其是在评价试剂盒检测限，特异性，灵敏度，准确性和稳定性中的一种或多种性能中的应用。本专利技术首次提出RNA全长质控品，拷贝数明确，稳定性强，可以适用于市面上所有核酸类试剂盒的性能评价。
[0032]上述该RNA病毒检测试剂盒质控品还可以在临床上模拟真实样本，可通过在RNA混合液中添加人源的RNA片段，用来模拟真实临床样本提取后含有人源RNA的情况。
[0033]上述该RNA病毒检测试剂盒质控品，含病毒基因组全长，可常温储存，批次间稳定性好，安全可再生，具有明确的拷贝数，可以满足市面上大部分试剂盒厂商以及检测机构的需求。
[0034]本专利技术的有益效果为：
[0035](一)本专利技术中的RNA病毒质控品含有病毒基因组全长，适用于市面上所有的病毒核酸类试剂盒的性能评价，PCR平台和NGS平台都适用，应用范围广。
[0036](二)本专利技术中的RNA病毒质控品常温储存，加水复溶后即可使用，不用进行RNA的提取操作，避免了不同使用者提取操作差异造成的影响，使用简单方便。
[0037](三)本专利技术中的RNA病毒质控品具有明确的拷贝数，可直接进行稀释成不同浓度的质控品，来很好的验证各家试剂盒的检测极限，极大的减少了临床上假阳性的可能性。
[0038](四)本专利技术的RNA病毒质控品制备本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于RNA病毒检测试剂盒的质控品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：获取至少一个待测病毒的RNA基因组序列，并生成对应的互补序列；将互补序列进行分段、合成、扩增和转录本的纯化处理；对处理后的每个核苷酸片段设计引物探针并确定RNA转录本的拷贝数；将上述每个RNA转录本混合后，加入保存稳定剂、冻干，获得RNA干粉；将所述RNA干粉中加水复溶、标定拷贝数，确定RNA质控品参数，获得所需RNA质控品。2.根据权利要求1所述的用于RNA病毒检测试剂盒的质控品的制备方法，其特征在于，对所述互补序列进行分段处理中，每个片段的大小不少于3000bp；优选地，所述互补序列每个片段之间有重叠区域，所述重叠区域大小为100
‑
500bp。3.根据权利要求1所述的用于RNA病毒检测试剂盒的质控品的制备方法，其特征在于，对所述互补序列进行合成处理包括：采用RNA聚合酶，以DNA双链为模板，体外合成RNA。4.根据权利要求1所述的用于RNA病毒检测试剂盒的质控品的制备方法，其特征在于，对所述互补序列进行合成之后、扩增处理之前，还包括：采用DNA酶消化反应液，去除DNA模板以及DNA酶的灭活处理；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：任锋，
申请(专利权)人：上海奥迪缇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：