用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物及一体式试剂盒制造技术

本申请涉及一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物及一体式试剂盒。所述组分物包括：用于第一次PCR扩增的引物组合物，以及用于第二次PCR扩增的引物探针组合物；其中，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物中引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3~50所示；所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物中引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:54~125所示。所述组合物采用巢式引物探针的设计，确保检测的准确性、灵敏度。包括所述组合物的一体式试剂盒配合其他检测试剂实现一次上样即可全封闭性同时提取、检测23种呼吸道病原核酸且保证高特异性、高时效的目的，同时该试剂盒易保存。同时该试剂盒易保存。同时该试剂盒易保存。

【技术实现步骤摘要】
用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物及一体式试剂盒


[0001]本申请涉及生物医药
，尤其是涉及一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物及一体式试剂盒。

技术介绍

[0002]致病微生物侵入呼吸道并进行繁殖导致的疾病称呼吸道感染。根据其部位分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。前者包括鼻炎、咽炎和喉炎；后者包括气管炎、支气管炎和肺炎。临床可出现相应症状，如发热、咳嗽、咳痰、呼吸困难等。咽喉部以及鼻粘膜、鼻腔等感染时，主要表现为咳嗽、咳痰、打喷嚏、流鼻涕、发热等，还有一些咽痛这些症状，严重的时候，如果出现咽喉部的水肿，会影响我们的呼吸，甚至发展到声带还可能出现声带水肿、声音嘶哑等症状。
[0003]呼吸道感染疾病的治疗必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素或抗病毒药，但由于能引起呼吸道感染的病原种类繁多，诸如：新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A、呼吸道合胞病毒B、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型，副流感病毒4型、鼻病毒、肠病毒、百日咳博代氏杆菌I、百日咳博代氏杆菌II、腺病毒、间质肺病毒、军团菌、副肠孤病毒属、结核分枝杆菌复合群、嗜血杆菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、肺炎支原体和肺炎衣原体等。而大多数检测方法的检测对象单一或较少，导致近半获得性社区肺炎的病原不能及时被确认，在致病病原不明或复合感染等情况下严重影响居民的生活健康。
[0004]呼吸道病原因种类众多，而使检测困难的问题非常突出，已成为呼吸道疾病防治的一个难题，所以呼吸道病原的确定成为解决该困境的首要条件，其检测方法主要有以下几种：(1)培养法：通过培养，获得足量病原进行细菌学检测，但周期长，且后续鉴定操作复杂，过程中易污染。(2)免疫法：通过抗原抗体检测，但检测对象单一，需多种产品协同检测，且存在灵敏度低，特异性不高等问题。(3)高通量测序法：需要对样本进行核酸提取，建库，测序，序列拼接等数据处理，对仪器设备的要求较高，测序成本大，检测时间长。(4)杂交检测法：采用PCR
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反向斑点杂交检测各种呼吸道病原，对样本进行核酸提取，PCR扩增后获得产物，再进行探针的杂交分析，需要进行额外的杂交，洗膜，显色等复杂操作，检测时间较长。(5)PCR检测法：成熟的荧光PCR技术，需增加检测检测产品种类，才能满足超多种类呼吸道病原的检测需求，对操作人员的技术要求较高。
[0005]传统病原培养法检测，需要大量时间进行培养来获得足够的病原进行鉴定，不同病原的培养方法不同，后续鉴定操作复杂且周期长，患者不能及时准确用药。免疫法的灵敏度和特异性不高，检测对象单一，不能满足众多呼吸道病原检测。测序法需要的仪器设备要求高，通常需要相关测序公司服务，检测成本高，检测时间同样较长，数据分析对检测人员的技术要求门槛高。杂交检测法相较于常规的PCR操作外还需要进行额外的杂交，洗膜，显色等复杂操作，操作较复杂。荧光PCR法作为成熟的呼吸道病原检测技术，相较于上述方法具有早期诊断、灵敏高和特异性强等特点。
[0006]常规的核酸检测采用实时荧光PCR方法，操作技能要求严格，需经专业培训。病原核酸提取较为麻烦，根据核酸提取的方式的不同一般耗时30分钟至120分钟不等、核酸扩增时间在2小时之内，而加上试剂准备、加样、结果分析等人工操作的时间，一般一次实验需要耗时4
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5小时，而且绝大多数PCR检测试剂只有4通道，除去质控基因外仅能检测3个靶标，而这种情况下，仅能确诊或排除3种病原。而呼吸道感染涉及数十种病原检测，需要进行更多种类的呼吸道病原荧光PCR检测剂配合使用。所以，易操作的多重呼吸道病原核酸检测在临床应用上也迫切需要。
[0007]基于微流控技术的实时荧光PCR即时检测(point
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of
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care testing,POCT)是目前国际基因检测的前端技术之一，将核酸提取与实时荧光基因检测通过微流控卡盒相结合，实现了样本到基因检测结果的全封闭自动输出，极大推动了POCT分子诊断领域的突破性发展。以美国Cepheid公司，罗氏公司，生物梅里埃公司为首的国际公司纷纷推出了分子POCT仪器和一体化荧光卡式试剂盒，已经开始在欧美分子检测市场快速占领市场。但其高成本限制了在经济欠发达地区的推广应用。

技术实现思路

[0008]为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物，以及包括所述组合物的一体式试剂盒，所述一体式试剂盒为分子POCT的多管多重基因检测装置，其对同一样本进行核酸提取和预扩增后，预扩增产物分流至多个(如8个)腔室内进行多重扩增，进而对多种待测病原体进行检测，检测结果准确、高效且试剂盒易保存。
[0009]为此，本申请第一方面提供了一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物，所述组分物包括：用于第一次PCR扩增的引物组合物，以及用于第二次PCR扩增的引物探针组合物；其中，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物包括24组分别用于对待检测的23种呼吸道病原体的核酸进行第一次PCR扩增的引物组；每组所述的引物组中均包括一条上游引物和一条下游引物，24组所述的引物组中引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3～50所示；所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物包括24组分别用于对23种呼吸道病原体核酸的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组；每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，24组所述的引物探针组中引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:54～125所示，且每条探针的5
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端均修饰有荧光报告基团，3
’
端均修饰有荧光淬灭基团。
[0010]本申请中，所述用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物采用巢式引物探针的设计，确保检测的准确性、灵敏度。同时，所述组合物中的上、下游引物和探针均针对各病原体的保守区域设计，保障了病原体内的包容性和准确度，且通过比对分析和优化设计，确认了不同病原体间的特异性。
[0011]本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3
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末端提供游离3
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OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3
’‑
OH基团，建立3
’
至5
’
磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
[0012]本申请中，术语“上游引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“下游引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和反链的指定发生互换时，对应的上游引物和下游引物的命名也可随之互换。也即，本申请中的上游引物和下游引物是相对而言的。
[0013]在一些实施方式中，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物中还包括一组针对内标基因的引物组，所述针对内标基因的引物组中的引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～2所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的组合物，其特征在于，所述组分物包括：用于第一次PCR扩增的引物组合物，以及用于第二次PCR扩增的引物探针组合物；其中，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物包括24组分别用于对待检测的23种呼吸道病原体的核酸进行第一次PCR扩增的引物组；每组所述的引物组中均包括一条上游引物和一条下游引物，24组所述的引物组中引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3~50所示；所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物包括24组分别用于对23种呼吸道病原体核酸的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组；每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，24组所述的引物探针组中引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:54~125所示，且每条探针的5
’
端均修饰有荧光报告基团，3
’
端均修饰有荧光淬灭基团。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述用于第一次PCR扩增的引物组合物中还包括一组针对内标基因的引物组，所述针对内标基因的引物组中的引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~2所示；和/或所述用于第二次PCR扩增的引物探针组合物中还包括一组用于对内标基因的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组，其中的引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:51~53所示，且探针的5
’
端均修饰有荧光报告基团，3
’
端均修饰有荧光淬灭基团。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述的23种呼吸道病原体分别为新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A、呼吸道合胞病毒B、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、 副流感病毒4型、鼻病毒、肠病毒、百日咳博代氏杆菌I、百日咳博代氏杆菌II、腺病毒、间质肺病毒、军团菌、副肠孤病毒属、结核分枝杆菌复合群、嗜血杆菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、肺炎支原体和肺炎衣原体。4.一种用于多种呼吸道病原体核酸检测的一体式试剂盒，其包括如权利要求1
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3中任意一项所述的组合物。5.根据权利要求4所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述一体式试剂盒上用旋转柱塞封闭隔离的各腔室中分别存放有裂解液、洗液1、洗液2、洗脱液、第一次PCR试剂、稀释液、封闭剂和第二次PCR试剂；所述第一次PCR试剂中包括所述组合物中的用于第一次PCR扩增的引物组合物，所述第二次PCR试剂中包括所述组合物中的用于第二次PCR扩增的引物探针组合物；优选地，用于存放所述洗液1和洗液2的腔室分别为2~3个；进一步优选地，用于存放所述第二次PCR试剂的腔室为5~8个，且所述24组分别用于对23种呼吸道病原体核酸的第一次扩增产物进行第二次PCR扩增的引物探针组被分配于不同腔室内。6.根据权利要求5所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述旋转柱塞上设置有多个不同的液体流道，每个液体流道分别在旋转柱塞旋转至不同角度下连通目的腔室。7.根据权利要求5或6所述的一体式试剂盒，其特征在于，所述一体式试剂盒上设置有活塞，通过所述活塞的移...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵怀，赵志敬，华灿忠，王倪霜，汪巧雯，
申请(专利权)人：杭州遂真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：