用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物探针组合、试剂盒及应用制造技术

本申请公开了一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物和探针组合、试剂盒及应用，其中引物如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.8所示，探针如SEQ ID NO.11~SEQ ID NO.34所示，其中引物基于巢式PCR分为外引物和内引物，探针分别匹配内引物。试剂盒包括上述引物和探针、反应液，以及基于POCT需要的封闭隔离材料、裂解液、洗液A、洗液B和可熔性材料。本申请引物探针在巢式PCR的基础上，结合实时荧光PCR技术，可以高灵敏和高特异性的同时对多个耐药基因的多个突变位点进行检测，同时试剂盒满足了微流控卡盒自动化的试剂需求，具有时效性、特异性、灵敏性、便捷性等多个方面的优点。便捷性等多个方面的优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物探针组合、试剂盒及应用


[0001]本申请属于分子生物学检测领域，涉及一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物探针组合、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的疾病，呈全球性分布，全世界有超过20亿的人群感染过HBV，其中有3.5亿为慢性HBV感染者。使用核苷类似物治疗乙肝已经成为目前全世界临床治疗乙肝的主流，现有5种常见的核苷类乙肝治疗药物：拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯。用于核苷初治患者时，某些核苷类药物的耐药发生率相对较高，如拉米夫定和阿德福韦的五年耐药率分别70％和29％。
[0003]但在乙肝治疗过程中，不能正确理解抗病毒治疗的意义和采取规范的抗病毒治疗，已使乙肝病毒变异、耐药逐渐成为抗病毒治疗道路上最大的绊脚石，如何及时的使用正确药物对于抗病毒治疗至关重要。研究表明，不同的基因突变可导致病毒对不同药物耐受性也不同，所以耐药基因检测逐渐成为乙型病毒肝炎治疗诊断的重要手段之一。
[0004]目前用于检测基因型耐药的方法主要有直接测序法、实时荧光聚合酶链式反应(Realtime PCR)及限制性片段质谱多态性技术等。具体的：
①
直接测序法：是将HBV核酸进行测序分析的方法。测序法可检测已知和可能的未知耐药变异位点，是最常用的基因型耐药检测方法之一，一般作为基因型耐药检测的金标准。该方法的缺点是单个样本检测价格昂贵，且耗时长。
②
实时荧光PCR：该方法操作简便，具有较强的灵敏性，可检测变异发生率低于10％的耐药变异。但是只能检测已知、单一位点的变异，对于少数耐药变异位点监测不失为一种简便、快速且廉价的方法。但该方法难以胜任多位点变异的同时检测。
③
限制性片段质谱多态性技术：该技术是将PCR
‑
RFLP技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术结合，灵敏度高，能够发现数量不足HBV准种池1％的变异株，且价格昂贵，很难在临床推广应用。
[0005]综上，现有针对乙型肝炎耐药基因的检测存在操作复杂、检测成本高、耗时长，且无法同时对多个突变位点进行检测，比如当采用单一位点变异检测的方法时，需要采集大量的血浆样本，不仅检测成本高，检测时间长，且会造成患者的不适，严重者甚至会损害患者健康。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的缺陷，本申请旨在提供一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物和探针组合，其中引物组合在巢式PCR的基础上，结合实时荧光PCR技术，可以高灵敏和高特异性的同时对多个耐药基因的多个突变位点进行检测。
[0007]另一方面，本申请基于实时荧光PCR即时检测(point
‑
of
‑
care testing，POCT)以及本申请的引物和探针体系，提供了一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的试剂盒，该
试剂盒基于POCT技术，可以一次性检测多种乙型肝炎病毒的耐药基因，对临床用药具有指导意义。
[0008]作为本申请的一个实施方案，提供了一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物组合，所述引物组合包括外引物和内引物：
[0009]所述外引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；
[0010]所述内引物分为内引物A、内引物B和内引物C；所述内引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物，所述内引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物，所述内引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物。
[0011]本申请引物组合基于巢式PCR的原理，先利用外引物进行扩增，再以外引物扩增得到的产物为底物，利用内引物进一步扩增得到目的基因片段，一方面由于靶序列需要同时与外引物和内引物互补配对，降低了非特异性扩增多个靶位点的可能，提高了扩增的特异性，另一方面，通过两次PCR扩增，可以增加有限量的靶序列，从而提高检测的灵敏度，因此，可以通过一次少量取样，即可实现同时检测不同耐药基因的不同突变位点，减少了取样量及取样次数。
[0012]进一步的，针对内引物扩增片段，本申请还提供了用于针对突变位点的特异性探针，所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.27所示。
[0013]其中，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示的特异性探针的结合位置分别位于内引物A的上游引物(SEQ ID NO.3)和下游引物(SEQ ID NO.4)之间；
[0014]核苷酸序列如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24所示的特异性探针的结合位置分别位于内引物B的上游引物(SEQ ID NO.5)和下游引物(SEQ ID NO.6)之间；
[0015]核苷酸序列如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.27所示的特异性探针的结合位置分别位于内引物C的上游引物(SEQ ID NO.7)和下游引物(SEQ ID NO.8)之间。
[0016]进一步的，所述特异性探针的5
′
端标记有荧光基团，3
′
端标记有淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、ROX或CY5，所述淬灭基团为MGB。
[0017]为了提高检测结果的准确性，降低假阳性的结果，本申请所述内引物还包括内标引物，所述内标引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物。
[0018]进一步的，还提供了与所述内标引物匹配的内标探针，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
[0019]作为本申请的第二个实施方案，提供了一种用于检测乙型肝炎病毒耐药基因的试剂盒，所述试剂盒包括所述引物组合、所述特异性探针和PCR反应液。优选的，所述PCR反应液选自热启动实时荧光PCR反应预混液(HotStart Realtime PCR(probe)MasterMix)。
[0020]在本实施方案中，所述热启动实时荧光PCR反应预混液主要含有HotStartTaq酶，该酶在Mg
2+
激活的条件下，具有高效的扩增活性，能够在使用时耐受试剂盒内可熔性材料熔化时所需的高温(20℃
‑
95℃)，能够在2
‑
8℃下长期保存，能够兼容多重PCR扩增，能够兼容不同TM值的荧光PCR。
[0021]优选的，所述热启动实时荧光PCR反应预混液包含10
‑
100mM Tris
‑
HCl或Tricine
‑
KOH，20
‑
100mM K
+
，1
‑
5mM Mg
2+
，2<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物探针组合，其特征在于，包括外引物、内引物和特异性探针：所述外引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；所述内引物分为内引物A、内引物B和内引物C；所述内引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物，所述内引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物，所述内引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；所述特异性探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.27所示。2.根据权利要求1所述的一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物探针组合，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.12所示的特异性探针的结合位置分别位于内引物A的上游引物和下游引物之间；核苷酸序列如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.24所示的特异性探针的结合位置分别位于内引物B的上游引物和下游引物之间；核苷酸序列如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.27所示的特异性探针的结合位置分别位于内引物C的上游引物和下游引物之间。3.根据权利要求1所述的一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物探针组合，其特征在于，所述特异性探针的5
′
端标记有荧光基团，3
′
端标记有淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、ROX或CY5，所述淬灭基团为MGB。4.根据权利要求1所述的一种用于检测乙型病毒性肝炎耐药基因的引物探针组合，其特征在于，所述内引物还包括内标引物，所述内标引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物；所述探针还包括匹配所述内标引物的内标探针，所述内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。5.一种用于检测乙型肝炎病毒耐药基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4中任一项所述引物探针组合和热启动实时荧光PCR反应预混液，所述热启动实时荧光PCR反应预混液包含10
‑
100mM Tris
‑
HCl或Tricine
‑
KOH，20
‑
100mM K
+
，1
‑
5mM Mg
2+
，2
‑
5wt％甘油，25
‑
250μM dNTPs，0.5
‑
2U HotStartTaq酶。6.根据权利要求5所述的一种用于检测乙型肝炎病毒耐药基因的试剂盒，其特征在于，第一次巢式PCR的反应体系为：10
‑
100mM Tris
‑
HCl或Tricine
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵怀，华灿忠，徐文彪，刘蒙蒙，
申请(专利权)人：杭州遂真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：