【技术实现步骤摘要】
基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选潜在弱毒疫苗的应用
[0001]本专利技术是关于病毒基因工程的
，特别是关于一种基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法及筛选弱毒疫苗的应用。
技术介绍
[0002]PEDV变异株致病性增强，感染仔猪表现为水样腹泻、厌食、脱水等，对新生仔猪的致死率高达100％。与经典株相比，变异株基因组上存在四个高变区，分别为V1，V2，V3，V4。V1位于ORF1a氮端，V2位于S基因S1区域，V3包含S基因3
’
端和ORF3基因5
’
端，V4位于N基因(参见Sun M,Ma J,Wang Y,et al.Genomic and epidemiological characteristics provide new insights into the phylogeographical and spatiotemporal spread of porcine epidemic diarrhea virus in Asia[J].J Cl...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、首先以CHM2013为骨架，构建和拯救分别置换BJ2011C结构蛋白编码区和S蛋白的嵌合病毒CHM2013
‑
SP
BJ
和CHM2013
‑
S
BJ
；再以CHM2013
‑
SP
BJ
为骨架，构建和拯救分别置换CHM2013结构蛋白的嵌合病毒CHM2013
‑
SP
BJ
‑
ORF3
CHM
、CHM2013
‑
SP
BJ
‑
E
CHM
、CHM2013
‑
SP
BJ
‑
M
CHM
和CHM2013
‑
SP
BJ
‑
N
CHM
，进行功能丧失性试验，探究PEDV变异株BJ2011C S蛋白和其它结构蛋白协同促进致病的分子基础；S2、以2日龄SPF仔猪为模型，口服5
×
105TCID
50
的嵌合病毒CHM2013
‑
SP
BJ
、CHM2013
‑
SP
BJ
‑
ORF3
CHM
、CHM2013
‑
SP
BJ
‑
E
CHM
、CHM2013
‑
SP
BJ
‑
M
CHM
和CHM2013
‑
SP
BJ
‑
N
CHM
进行功能丧失性试验，通过临床情况、每日排毒情况、肠道病理变化和肠道定殖情况分析嵌合病毒对仔猪的致病性，结果显示，与CHM2013
‑
SP
BJ
相比，CHM2013
‑
SP
BJ
‑
N
CHM
致病性没有减轻；CHM2013
‑
SP
BJ
‑
M
CHM
和CHM2013
‑
SP
BJ
‑
E
CHM
的致病性有所降低；CHM2013
‑
SP
BJ
‑
ORF3
CHM
丧失了致病性；得到PEDV变异株S基因协同结构蛋白ORF3、E和M促进病毒致病，其中S基因协同ORF3促进致病最关键；S3、根据功能丧失性试验结果，以CHM2013
‑
S
BJ
为骨架，构建和拯救置换BJ2011CORF3的嵌合病毒CHM2013
‑
(S+ORF3)
BJ
，进行功能获得性试验，进一步探究S蛋白和ORF3协同促进致病的分子基础；S4、以2日龄SPF仔猪为模型，口服5
×
105TCID
50
的嵌合病毒CHM2013
‑
S
BJ
和CHM2013
‑
(S+ORF3)
BJ
，通过临床情况、每日排毒情况、肠道病理变化和肠道定殖情况分析嵌合病毒对仔猪的致病性，进一步确定高毒力毒株BJ2011C S基因和结构蛋白ORF3是否协同促进病毒致病，结果显示，CHM2013
‑
(S+ORF3)
BJ
的致病性高于CHM2013
‑
S
BJ
，得到PEDV变异株BJ2011C S基因协同结构蛋白ORF3促进病毒致病。2.如权利要求1所述的基于反向遗传操作的PEDV嵌合病毒致弱的鉴定方法，其特征在于，还包括：S5、仔猪攻毒后，每日记录仔猪的存活情况，分别于仔猪攻毒前、仔猪死亡时和动物实验结束时称量仔猪体重并记录，仔细观察根据评分标准对仔猪腹泻程度和精神状态进行记录并评分，通过比较存活曲线、平均增重、临床评分和腹泻评分结果；在功能丧失性试验中与CHM2013
‑
SP
BJ
相比，CHM2013
‑
SP
BJ
‑
N
CHM
具有致死性和致病性，CHM2013
‑
SP
BJ
‑
M
CHM
和CHM2013
‑
SP
BJ
‑
E
CHM
致病性有所降低，感染仔猪出现腹泻症状，CHM2013
‑
SP
BJ
‑
ORF3
CHM
丧失了致病性，感染仔猪临床症状表现为正常；在功能获得性试验中相比于CHM2013
‑
S
【专利技术属性】
技术研发人员：韩军，王晨，王迪，李劼，杨汉春，盖新娜，周磊，张永宁，郭鑫，高鹏，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。