用于检测异常成红细胞的工具和方法技术

本发明专利技术涉及用于检测、诊断、监测或预测受试者骨髓中病理状态的方法，所述方法至少包括确定受试者体液样品中异常成红细胞的存在的步骤。还设想了异常成红细胞作为用于诊断、检测、监测或预测受试者骨髓中病理状态的标记的用途，以及用于诊断、检测、监测或预测受试者骨髓中病理状态的套件，其包括用于确定受试者样品中存在以下项的工具：(i)CD71和/或GPA，(ii)CD45，(iii)稀有循环细胞的核酸，以及(iv)EpCam或(v)波形蛋白中的至少一种。EpCam或(v)波形蛋白中的至少一种。EpCam或(v)波形蛋白中的至少一种。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测异常成红细胞的工具和方法


[0001]本专利技术涉及用于检测、诊断、监测或预测受试者骨髓中病理状态的方法，所述方法至少包括确定受试者体液样品中异常成红细胞(erythroblast)的存在的步骤。还设想了异常成红细胞作为用于诊断、检测、监测或预测受试者骨髓中病理状态的标记的用途，以及用于诊断、检测、监测或预测受试者骨髓中病理状态的套件(composition)，其包括用于确定受试者样品中存在以下项的工具：(i)CD71和/或GPA，(ii)CD45，(iii)稀有循环细胞的核酸，以及(iv)上皮细胞粘附分子(EpCam)或(v)波形蛋白(vimentin)中的至少一种。

技术介绍

[0002]人类肿瘤发生的驱动力是多因素的，且个体间各不相同，通常需要数年才能在全身表现出来。这种发展表现为从良性到恶性、异型增生到形成肿瘤以及从局部发展到全身。其复杂性阻碍了对癌症的可逆性和肿瘤生长速度的深入或全面了解。在细胞水平上，恶性肿瘤的发展可以通过每个克隆获得的稳定遗传突变数以及肿瘤细胞之间的突变和由此带来的表型异质性来衡量。假设一个细胞必须获得至少6个肿瘤相关突变，其才具有恶性性质。遗传改变遵循系统发育，因此代表了一个进化过程，并导致表型改变、细胞去分化，从而在其他非常特殊的细胞环境中丧失功能。
[0003]在许多情况下，仍在使用已有一个世纪历史的分级系统，该系统以分化程度为导向，并转化为对肿瘤侵袭性的评估。对肿瘤侵袭性的评估(可定义为肿瘤在给定时间段侵袭其他组织区域以及建立远处微转移的能力)可转化为预测，并可能具有治疗意义。在细胞水平上，肿瘤侵袭性可与克隆倍增时间、细胞分化程度以及遗传上不同的肿瘤细胞群的多样性直接相关。因此，侵袭性肿瘤的质量会迅速增加，但更重要的是多形性肿瘤的克隆异质性。因此，这最终提高了某些肿瘤细胞在敌对或非天然的远处组织区域茁壮生长的可能性。侵袭性癌症类型的特别实例是胰腺腺癌。
[0004]肿瘤细胞扩散和建立稳定的微转移事件标志着从局部疾病向全身性疾病的转变，从而从可治疗的疾病演变为通常致命的疾病。特别是，假设骨和骨髓构成几种癌症类型(如乳腺、前列腺和肺肿瘤)的转移支持性生态位(niche)。骨转移癌症患者被视为“高危”患者，因为可用的有帮助的治疗方法很少。大多数转移性发展通常直到生长的最后阶段还没有被发现或识别到。普遍认为，需要对大多数癌症类型进行早期检测，以通过各种治疗方式防止早期死亡，并在转化为全身表现之前检测到疾病。然而，目前的诊断技术通常局限于识别早期癌症，通过偶然或器官特异性筛查来检测早期肿瘤，例如常见的乳腺癌筛查项目。
[0005]在液体活组织检查中，正在研究肿瘤细胞脱落到血液循环中的过程，这通常被认为是支持或代表微转移的开始。目前正在研究在个体和癌症类型水平上导致肿瘤细胞及时发生脱落的因素。在乳腺癌患者的早期阶段中，骨髓驻留肿瘤细胞(称为播散性肿瘤细胞)的发现支持了早期肿瘤细胞播散的理论，并因此证明了通过基于细胞的液体活组织检查检测早期癌症的通用能力。进一步的常识是，在任何类型的应激诱导下，细胞从骨髓组织到循环中的流出增加。此外，已发现肌病、腺瘤、结肠息肉、胰腺囊肿等等非恶性肿瘤的组织病变
会使细胞从受累区域进入血液循环。
[0006]因此，假设任何阶段的任何组织病变都可能导致细胞进入循环，从而形成循环的稀有细胞谱。这类特殊的微小细胞事件，尤其包括绝大多数血细胞中的恶性、良性、体细胞和干细胞或祖细胞，如果不是疾病发展的原因，也是指示性的，因此具有显著的诊断潜力。
[0007]目前，骨髓被认为是稀有细胞谱的主要来源。在病理以及生理条件下，存在修复或维持非造血和造血谱系骨髓源性细胞植入的驱动因素。此外，骨髓本身可能是不平衡的，例如发炎的骨髓组织，并因此引发细胞不受控地进入循环。因此，需要在细胞免疫和修复系统的故意过程以及由骨髓或多或少的严重损伤引起的被动非故意过程中识别骨髓细胞流出。因此，如本专利技术人所发现的，系统癌症进化在全身性扩散之前是可检测的，并且可以在其原位病变、增生或炎症位点的最开始时进行检测。
[0008]目前对潜在癌症患者的诊断方法相当复杂且难以掌握(Sch
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nemann et al.,Breast Cancer Screening and Diagnosis:A Synopsis of the European Breast Guidelines,Ann Intern Med,2020,172:46
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56；Iaccarino和Wiener,Diagnostic Evaluation After Lung Cancer Screening in Real
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World Practice:More Questions Than Answers,2020,Chest 157(2),247
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248)。筛选阳性患者必须经受确认恶性肿瘤的方法，这些方法大多限于由病理学家在细胞水平上对组织样品进行检查，并涉及探索性组织活检或癌症手术。随后必须进行单独调查，以评估转移情况。每个测试阶段通常都具有限制和缺点。每一个单独的诊断步骤都无法呈现出癌症的完整或正确情况。
[0009]因此，需要一种有效且准确的诊断方法，其允许正确且快速地评估肿瘤及其侵袭性并采纳潜在的治疗方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术解决了这种需求，并提供了一种用于检测、诊断、监测或预测受试者骨髓中病理状态的方法，该方法至少包括确定受试者体液样品中异常成红细胞的存在的步骤。本专利技术基于以下发现：骨髓源性的循环稀有细胞群构成了对骨髓状况的反映。本专利技术人惊奇地发现，确定受试者体液样品中异常成红细胞的存在以及它们的分子和表型分析可有利地用于补充并因此改善癌症的诊断。因此，本专利技术基于在受癌症和其他疾病困扰的个体的血液循环中发现异常骨髓天然细胞。在与骨髓损伤相关的已知病症的背景下，骨髓源性异常成红细胞的发现使专利技术人达到这样的前提，即循环成红细胞谱在一定程度上反映了每个个体的骨髓状态。因此，将该观察转化为无需抽吸骨髓的骨髓分析的专利技术，从而允许高可靠性地预测骨髓损伤。
[0011]因此，在某些方面，本专利技术特别可用于检测骨转移。此外，本专利技术通过检测骨髓的肿瘤细胞侵袭，支持根据全身性肿瘤细胞扩散而言的肿瘤分期。因此，本专利技术对实体组织癌具有两个诊断意义；一个是进入肿瘤侵袭性的新型强有力的诊断窗口，二是支持描绘转移。因此，本专利技术涉及骨髓抽吸的潜在替代物，或者要求在组织癌分期方面骨髓抽吸诊断实践的等同物，具有其在患者护理、敏感性和成本方面的所有优点。此外，本专利技术涉及简化的临床前和临床后诊断应用，其用于处理需要即时临床反应或在短时间内监测的急性病症。
[0012]在上述方法的优选实施例中，所述样品是静脉血样品或外周血样品，优选下腔静脉样品或门静脉样品。
[0013]在另一个优选实施例中，所述确定包括确定所述成红细胞的倍性(ploidy)和潜在存在的(i)核出芽或分叶表型，(ii)核间桥，(iii)单个细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测、诊断、监测或预测受试者骨髓中病理状态的方法，所述方法至少包括确定受试者体液样品中异常成红细胞的存在的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是静脉血样品或外周血样品，优选下腔静脉样品或门静脉样品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述确定包括确定所述成红细胞的倍性和潜在存在的(I)核出芽或分叶表型，(ii)核间桥，(iii)单个细胞中的两个或多个核，(iv)巨幼红细胞，(v)巨成红细胞，(vi)同步细胞质分裂的成红细胞，(vii)包含至少3个黏附成红细胞的成红细胞聚集体，(viii)成红细胞核内倍性增加。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述异常红系细胞表现出增加的倍性，优选具有双核或多核表型。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述确定还包括确定受试者样品的细胞中存在至少CD71和/或GPA，以及任选地存在CD44、CD45、VAV1、Kell血型蛋白和核酸中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的方法，其中鉴定到表现出增加的核内和/或细胞内倍性、核出芽或分叶表型、核间桥、单个细胞中的两个或多个核、巨幼红细胞外观、巨成红细胞外观的异常成红细胞，同时鉴定到所述样品中成红细胞的CD71
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(阳性)和/或GPA
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(阳性)和CD45
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(阴性)生物化学状态，指示骨髓病症，例如骨髓增生异常综合征/急性髓性白血病、淋巴瘤、原发性血小板增多症或糖尿病。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述确定还包括确定受试者样品的细胞中存在EpCam和细胞角蛋白，以及任选存在波形蛋白。8.根据权利要求5或7所述的方法，其中所述确定还包括确定受试者样品的细胞是否以细胞簇的形式存在。9.根据权利要求7或8所述的方法，其中鉴定到表现出增加的核内和细胞内倍性、核出芽或分叶表型、核间桥、单个细胞中的两个或多个核、巨幼红细胞外观、巨成红细胞外观的异常成红细胞，同时鉴定到所述样品中成红细胞的CD71
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(阳性)和/或GPA
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(阳性)和CD45
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(阴性)生物化学状态，以及鉴定到样品中的EpCam
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(阳性)或细胞角蛋白
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(阳性)细胞，指示侵袭性实体组织癌。10.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述确定还包括所述样品中细胞的形态学分析，优选在细胞的迈格吉法(MGG)染色之后进行形态学分析。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述细胞形态学分析包括将样品中的细胞分类为：
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1类，其中所述样品包括圆形或椭圆形并且包含一个核的细胞；
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2类，其中所述样品包括圆形或椭圆形并且包含至少两个核的细胞；
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3类，其中所述样品包括含有收缩的细胞对；和
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4类，其中所述样品包括具有一个核或多个核的至少三个圆形或椭圆形细胞的聚集体。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述1类包括将所述细胞进一步分为以下亚类：
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1a类，其中所述样品包含直径约6.5μm至12.4μm的正常成红细胞，其具有致密核和高核质比；
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1b类，其中所述样品包含直径>12.5μm的巨循环成红细胞，其具有至少一个直径为约6
至10μm的低密度核和低核质比；
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1c类，其中所述样品包含具有核质异步和中至高密度染色质和高核质比的巨幼红细胞；和
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1d类，其中所述样品包含直径约4μm至6μm的巨成红细胞，其具有无核质异步的总凝缩核和低核质比。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述2类包括将所述细胞进一步分为以下亚类：
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2a类，其中所述细胞为双核；和
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2b类，其中所述细胞包含至少3个核。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述3类包括将所述细胞进一步分为以下亚类：
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3a类，其中所述细胞未显示核桥；和
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3b类，其中所述细胞显示核桥，并且其中所述核在大小、形状和/或染色质密度表现不相等。15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述确定还包括确定以下至少一种比率：(i)1a类细胞与1c/1d类细胞；(ii)1a类细胞与2类细胞；和(iii)1a类细胞与3类细胞，以及循...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：S，
类型：发明
国别省市：