一种针对骨吸收代谢状态的β-CTx化学发光检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术的目的在于提供一种针对骨吸收代谢状态的β

【技术实现步骤摘要】
一种针对骨吸收代谢状态的
β
‑
CTx化学发光检测方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于骨密度检测相关
，具体涉及一种针对骨吸收代谢状态的β
‑
CTx化学发光检测方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]国际上公认的骨质疏松检测方法是骨密度监测，包括单光子吸收测定法、双能X线吸收测定法、定量CT法、超声骨密度测定法等。但是骨密度反应的是骨骼形态学的改变，往往需要几年的时间才会发生变化，因此不能及时反馈人体骨骼生长和骨质疏松相关药物的治疗效果，并且骨密度检测仪器成本较高，特定医院才会配置，不适合大范围推广。
[0003]骨质疏松指标指南中推荐β胶原特殊序列(β
‑
CTx)作为快速评价骨质疏松诊断和治疗效果的指标。β
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CTx是骨吸收过程中产生的特异性代谢产物，反馈了破骨细胞相关的骨吸收水平的变化。正常骨代谢期间，成熟的I型胶原会被降解，形成的小片段进入血液后通过肾脏排泄。生理或病理性骨吸收增强时(如老年人或骨质疏松症)，I型胶原的降解也增高，血液中的胶原片段含量随之也相应升高。检测β
‑
CTx骨吸收标志物便可测得破骨细胞的活性，能反映短期内骨量的变化，对诊断与监测骨质疏松症、骨关节病等骨代谢病具有重要价值。因此，有必要开发针对骨代谢循环系统的检测方法，以快速准确反应人体骨骼变化情况，可以用于骨质疏松的诊断筛查。
[0004]到目前为止，用于检测人血清中β
‑
CTx的方法主要有：酶联免疫法(ELISA)放射性免疫检测法和化学发光检测法。但是当前的这些方法的灵敏度不高，线性范围窄，准确度低，重复性差。因此当前需要对上述方法进行改进来满足检测的需要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种针对骨吸收代谢状态的β
‑
CTx化学发光检测方法和试剂盒，其采用辣根过氧化物作为化学发光标记物，具有灵敏度高，线性范围宽，准确度高，重复性好的优点，并且辣根过氧化物分子量小，不影响抗体的空间位阻。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案。
[0007]一种针对骨吸收代谢状态的β
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CTx化学发光检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
[0008]步骤1：进行第一次孵育：加入30μL被测样本和60μL的β
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CTx试剂R1到包被有链霉亲和素偶联物的微孔中，一起孵育15min，使抗原从血清中释放出来；
[0009]所述β
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CTx试剂R1具体为：生物素化的β
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CTx捕获抗体；
[0010]步骤2：进行第二次孵育：加入60μL的β
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CTx试剂R2，孵育15min；
[0011]所述β
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CTx试剂R2具体为：辣根过氧化物酶标记的β
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CTx检测抗体；
[0012]步骤3：进行清洗：即吸取350μL清洗液加入到微孔中，清洗4次，将未结合在固相上的抗体和被测样本被清除；
[0013]步骤4：进行读数：加入化学发光底物A、化学发光底物B，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；
[0014]步骤5：进行利用已知浓度的定标品绘制发光强度标准曲线，根据步骤4得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的骨吸收代谢状态的β
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CTx含量。
[0015]进一步的，所述链霉亲和素偶联物具体为：生物素化牛血清白蛋白与链霉亲和素的偶联物。
[0016]进一步的，所述清洗液具体为：含0.1％吐温20和0.1％ Proclin300的0.05M、pH值为7.5的Tris
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HCl溶液。
[0017]进一步的，所述底物液A具体为含有0.4％鲁米诺，pH9.0的水溶液；所述底物液B具体为含有0.06％四硼酸钠，pH5.0的水溶液。
[0018]进一步的，所述β
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CTx试剂R1的配置方法为：取27.44g K2HPO4、5.76gKH2PO4、30g牛血清白蛋白、30g牛γ球蛋白、3.5g小鼠血清加入到1L纯化水中，调节pH为7.3，再加入2mg生物素化β
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CTx抗体、2mg消泡剂204、10g PROCLIN300配置成β
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CTx试剂R1。
[0019]进一步的，所述β
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CTx试剂R2的配置方法为：取1.8g K2HPO4、5.4gKH2PO4、30g/L牛血清白蛋白、0.4g ANS、10mg铁氰化钾加入到1L纯化水中，调节pH为7.2，再加入2mgβ
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CTx抗体
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HRP、2mg消泡剂204、10gPROCLIN300配置成β
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CTx试剂R2。
[0020]进一步的，所述定标品具体为：将一定量的β
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CTx抗原添加至马血清中，配置成浓度约为0pg/mL、50pg/mL、200pg/mL、600pg/mL、2000pg/mL和6000pg/mL的定标品。
[0021]基于上述检测方法，本专利技术还提供了一种针对骨吸收代谢状态的β
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CTx化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括链霉亲和素偶联物包被的微孔、β
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CTx试剂R1、β
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CTx试剂R2、定标品、化学发光底物液A和底物液B、浓缩清洗液。
[0022]进一步的，所述化学发光底物液A和底物液B、浓缩清洗液均以独立包装提供。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具备以下有益效果：
[0024]1、本专利技术采用化学发光双抗体直接夹心法体外定量检测被测样本中的β
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胶原特殊序列(β
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CTx)的含量；在预包被链霉亲和素和生物素化牛血清白蛋白的微孔中加入被测样本后，再加入生物素化β
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CTx抗体(IgG)，然后加入β
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CTx抗体
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HRP酶结合物，则被测样本中所含的β
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CTx将会与之形成抗体—抗原—抗体—酶复合物；再洗去未结合在固相上的反应物，加入化学发光底物，化学发光底物在HRP酶的催化下发光，然后读取相对发光强度(RLU)，最后通过校准曲线计算样本中β
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CTx的浓度，上述方法实现针对骨吸收代谢状态的β
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CTx的检测。
[0025]2、本方法具有高灵敏度：生物素与抗体形成的生物素衍生物不仅保持了抗体的原有生物活性，并且每个链霉亲合素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标记物，因此具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
[0026]3、本方法具有明显的特异性：链霉亲和素与生物素间具有极高的亲和力，其反应呈高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对骨吸收代谢状态的β
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CTx化学发光检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：步骤1：进行第一次孵育：加入被测样本和β
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CTx试剂R1到包被有链霉亲和素偶联物的微孔中，一起孵育，使抗原从血清中释放出来；所述β
‑
CTx试剂R1具体为：生物素化的β
‑
CTx捕获抗体；步骤2：进行第二次孵育：加入β
‑
CTx试剂R2，孵育；所述β
‑
CTx试剂R2具体为：辣根过氧化物酶标记的β
‑
CTx检测抗体；步骤3：进行清洗：即吸取清洗液加入到微孔中，将未结合在固相上的抗体和被测样本被清除；步骤4：进行读数：加入化学发光底物A、化学发光底物B，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；步骤5：进行利用已知浓度的定标品绘制发光强度标准曲线，根据步骤4得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的骨吸收代谢状态的β
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CTx含量。2.根据权利要求1所述的一种针对骨吸收代谢状态的β
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CTx化学发光检测方法，其特征在于：所述链霉亲和素偶联物具体为：生物素化牛血清白蛋白与链霉亲和素的偶联物。3.根据权利要求1所述的一种针对骨吸收代谢状态的β
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CTx化学发光检测方法，其特征在于：所述清洗液具体为：含0.1％吐温20和0.1％Proclin300的0.05M、pH值为7.5的Tris
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HCl溶液。4.根据权利要求1所述的一种针对骨吸收代谢状态的β
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CTx化学发光检测方法，其特征在于：所述底物液A具体为含有0.4％鲁米诺，pH9.0的水溶液；所述底物液B具体为含有0.06％四硼酸钠，pH5.0的水溶液。5.根据权利要求1所述的一种针对骨吸收代谢状态的β
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CTx化学发光检测方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：任和，刘萌，郭超林，白仲虎，
申请(专利权)人：江苏拜明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：