一种25-羟基维生素D的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术的目的在于提供一种25

【技术实现步骤摘要】
一种25
‑
羟基维生素D的检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于25
‑
羟基维生素D检测相关
，具体涉及一种25
‑
羟基维生素D的检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]维生素D是人体不可缺少的维生素，它有以下生理功能：1提高肌体对钙、磷的吸收；2、促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全；3、通过肠壁增加磷的吸收，并通过肾小管增加磷的再吸收；4、防止氨基酸通过肾脏损失。人体缺乏维生素D会引起佝偻病、手足抽搐和软骨病。长期摄入过多的维生素D(5000IU/日)，将引起高血钙和高尿钙。
[0003]维生素D在肝脏和肾脏转化成为有生物活性的25
‑
羟基维生素D(25
‑
OHD)和25
‑
二羟基维生素D。由于25
‑
羟基维生素D是人体内维生素D的主要储存形式。因此通过检测25
‑
羟基维生素D(包括25
‑
羟基维生素D2与25
‑
羟基维生素D3)可以评估人体维生素D水平，进而评价钙吸收水平、协助临床疾病的诊断和监测并确定钙和维生素D的补充方案。
[0004]25
‑
OHD的主要理化检测方法有高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)和液相色谱质谱法(Liquid chromatography mass spectrometry，LC
‑r/>MS)。HPLC技术具有良好的精密度和准确度，但由于其操作复杂，反应时间长，所需样本量大，故不适于临床应用。LC
‑
MS是在HPLC基础上发展起来的一项新的检测技术，现为色谱法中最为常用的25
‑
OHD检测方法。LC
‑
MS技术可完全满足临床检测方法要求的准确性，灵敏度，特异性，该方法已经被美国国家疾控中心采用的参考方法，被认为是检测25
‑
OHD的金标准。虽然LC
‑
MS具有以上优点，但同时也存在着样品前处理繁琐，技术操作复杂，需要专业人员，仪器昂贵，检测周期长，自动化程度不高等缺点，限制着LC
‑
MS在临床检测中的应用。
[0005]因此，当前亟需设计一种操作简便、特异性高、灵敏度好的用于检测人血清中25
‑
羟基维生素D的方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种25
‑
羟基维生素D的检测方法及试剂盒，其采用化学发光竞争法，操作简便、特异性高、灵敏度好，能够满足现有的检测需求。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案。
[0008]一种25
‑
羟基维生素D的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
[0009]步骤1、进行第一次孵育：加入30μL被测样本和150μL孵育缓冲液到化学发光微孔板中一起孵育，使与维生素D结合蛋白结合的25
‑
羟基维生素D转换成游离态，并与化学发光微孔板中的固相抗体结合；
[0010]步骤2、进行第一次清洗：吸取350μL清洗液加入到化学发光微孔板中，清洗4次，洗去未结合在固相上的物质；
[0011]步骤3、进行第二次孵育：加入100μL的酶结合物溶液一起孵育，与化学发光微孔板上尚未结合的25
‑
羟基维生素D抗体结合；
[0012]步骤4、进行第二次清洗：吸取350μL清洗液加入到化学发光微孔板中，清洗4次，洗去未结合在固相上的物质；
[0013]步骤5、进行读数，加入化学发光底物A、化学发光底物B，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；
[0014]步骤6、利用已知浓度的定标品绘制发光强度标准曲线，根据步骤5得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的25
‑
羟基维生素D含量。
[0015]进一步的，所述孵育缓冲液的配置方式为：取9.55mL卡松、38.2g牛血清白蛋白、133.64mL丙二醇加入1L水中，调pH为7.0进行配制。
[0016]进一步的，所述化学发光微孔板为包被有25
‑
羟基维生素D抗体。
[0017]进一步的，所述25
‑
羟基维生素D抗体的浓度为3μg/mL。
[0018]进一步的，所述酶结合物溶液的配置方式为：取60.55g蔗糖、6.05g 2
‑
氯乙酰胺、1.21g牛血清白蛋白、0.12g铁氰化钾、1.21mL Proclin300，调pH为7.0进行配置，再加入0.25％25
‑
羟基维生素D
‑
HRP偶联物。
[0019]进一步的，所述化学发光底物A为含有0.4％鲁米诺，pH9.0的水溶液；所述化学发光底物B为含有0.06％四硼酸钠，pH5.0的水溶液；所述清洗液为含1％吐温20和0.1％Proclin300的0.05M、pH值为7.5的Tris
‑
HCl溶液。
[0020]进一步的，所述定标品的配置方式为：将25
‑
羟基维生素D抗原添加至马血清中，配置成浓度约为0ng/mL、7.5ng/mL、15ng/mL、30ng/mL、60ng/mL和120ng/mL的定标品。
[0021]进一步的，所述步骤1和步骤3中的孵育时间均为15分钟。
[0022]基于上述检测方法，本专利技术还提供了一种25
‑
羟基维生素D的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括化学发光微孔板、孵育缓冲液、酶结合物溶液、定标品、化学发光底物A、化学发光底物B和清洗液。
[0023]进一步的，所述化学发光底物A、化学发光底物B和清洗液均为独立包装。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具备以下有益效果：
[0025]1、本专利技术检测样品中25
‑
羟基维生素D的免疫学方法为化学发光竞争法。首先用纯化的25
‑
羟基维生素D抗体包被化学发光微孔板制成固相抗体，然后往化学发光微孔板的微孔中依次加入样本与孵育缓冲液，使与维生素D结合蛋白结合的25
‑
羟基维生素D转换成游离态，游离态的25
‑
羟基维生素D与微孔中的固相抗体结合；洗涤除去未结合物质后加入浓度一定的HRP标记过的25
‑
羟基维生素D偶联物,与微孔中未与样本中25
‑
羟基维生素D结合的抗体结合；洗涤除去未结合物质后加入化学发光底物A和B。化学发光底物在HRP酶的催化下发光，然后用化学发光免疫分析仪读取相对发光强度(RLU)，最后通过校准曲线计算样品中25
‑
羟基维生素D的浓度，实现了检测样品中25
‑
羟基维生素D含量的功能。
[0026]2、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种25
‑
羟基维生素D的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：步骤1、进行第一次孵育：加入被测样本和孵育缓冲液到化学发光微孔板中一起孵育，使与维生素D结合蛋白结合的25
‑
羟基维生素D转换成游离态，并与化学发光微孔板中的固相抗体结合；步骤2、进行第一次清洗：吸取清洗液加入到化学发光微孔板中，洗去未结合在固相上的物质；步骤3、进行第二次孵育：加入的酶结合物溶液一起孵育，与化学发光微孔板上尚未结合的25
‑
羟基维生素D抗体结合；步骤4、进行第二次清洗：吸取清洗液加入到化学发光微孔板中，洗去未结合在固相上的物质；步骤5、进行读数，加入化学发光底物A、化学发光底物B，酶催化底物发光，通过光电倍增器测量发光强度；步骤6、利用已知浓度的定标品绘制发光强度标准曲线，根据步骤5得到的发光强度对照所述发光强度标准曲线，计算得出待测样本中的25
‑
羟基维生素D含量。2.根据权利要求1所述的一种25
‑
羟基维生素D的检测方法，其特征在于：所述孵育缓冲液的配置方式为：取9.55mL卡松、38.2g牛血清白蛋白、133.64mL丙二醇加入1L水中，调pH为7.0进行配制。3.根据权利要求1所述的一种25
‑
羟基维生素D的检测方法，其特征在于：所述化学发光微孔板为包被有25
‑
羟基维生素D抗体。4.根据权利要求3所述的一种25
‑
羟基维生素D的检测方法，其特征在于：所述25
‑
羟基维生素D抗体的浓度为3μg/mL。5.根据权利要求1所述的一种25
‑
羟基维生素D的检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：任和，郭超林，李帅鹏，白仲虎，
申请(专利权)人：江苏拜明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：