用于评估生物制药开发过程中聚山梨醇酯降解风险的高通量、基于荧光的酯酶活性测定法制造技术

本公开提供了用于检测脂肪分解活性的组合物、方法和试剂盒。在一些实施例中，所述组合物包含水性测定样品和有机溶剂，其中所述有机溶剂包含辛酸4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于评估生物制药开发过程中聚山梨醇酯降解风险的高通量、基于荧光的酯酶活性测定法

技术介绍

[0001]基于蛋白质的生物治疗药物在治疗严重疾病诸如多种形式的癌症和免疫介导的疾患方面取得了巨大的成功。但是，尽管过去几十年生物治疗药物制造技术取得了进步，但肠胃外蛋白质制剂仅限于少数常用的表面活性剂，每种表面活性剂都有其自身特有的缺点和挑战。聚山梨醇酯(PS)代表生物治疗药物制剂中最常见的一类表面活性剂，并且在蛋白质稳定性、生物相容性和安全性方面树立了标杆。最常用的聚山梨醇酯PS20和PS80由脱水山梨糖醇的核心组成，即经过聚乙氧基化和脂肪酸酯化(在PS20中主要为月桂酸，在PS80中主要为油酸)山梨聚糖与异山梨醇的混合物。聚山梨醇酯的降解可通过氧化或化学水解发生，导致游离脂肪酸(FFA)的积累。随时间推移(在药物产品的保质期内)的降解是一个问题，因为它可能导致：(i)由于聚山梨醇酯降解物的不溶性物质而产生可见颗粒物；(ii)对蛋白质质量的不利影响；(iii)表面活性剂浓度降低，导致蛋白质对界面应力的保护不足；(iv)药物产品安全性特征的潜在差异。
[0002]引起PS降解的一个主要因素是宿主细胞蛋白质(HCP)。基于蛋白质的治疗剂通常通过在哺乳动物或微生物细胞培养物中表达治疗性蛋白质来产生。通过从细胞培养上清液中分离表达的靶蛋白来制备蛋白质制剂。除表达治疗性蛋白质以外，这些细胞培养物还产生其自身的天然蛋白质(即HCP)，这些蛋白质可能污染蛋白质制剂并且使聚山梨醇酯水解。下游纯化工艺去除包含治疗性蛋白质的上清液中存在的大部分HCP；但是，通常残留痕量的HCP。有时在蛋白质制剂中鉴别出并且与水解降解相关联的HCP蛋白质的实例包括溶酶体磷脂酶A2(LPLA2),假定磷脂酶B样2(PLBL2)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝羧酸酯酶B
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1样(CES
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B1L)和肝羧酸酯酶1样(CES
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1L)。由于典型药物产品(DP)中水解酶(HCP)的量极低，并且PS降解可能归因于一种或多种具有高催化活性的酶，因此难以测量给定蛋白质制剂中引起HCP降解的全部范围和种类。
[0003]已经开发出多种方法来检测聚山梨醇酯降解。高效液相色谱(HPLC)与蒸发光散射检测器(ELSD)联用，为测量和定量溶液中完整的聚山梨醇酯提供了有用的工具。配备ELSD的缓梯度反相色谱法可以对聚山梨醇酯和亚种进行分离和定性评估，但无法实现稳健的定量。最近报道了一种FFA测定法的开发和实施，该测定法可使用配备光电二极管阵列(PDA)检测器的反相超高效液相色谱(UHPLC)对聚山梨醇酯溶液中存在的脂肪酸进行定量。还已报道了其他质谱方法用于对聚山梨醇酯降解的产物进行定量。这些方法耗费时间，并且在发生足够程度的降解之前不具有检测聚山梨醇酯含量变化的灵敏度。
[0004]最近开发的用于检测酯酶活性的方法使用荧光或显色底物，这些底物已被修饰为含有脂肪酸侧链以模拟聚山梨醇酯酯键。伞形酮的酰氧基甲基醚和1
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酰氧基
‑1‑
氰基
‑3‑
丙醚已被鉴别为用于酯酶和脂肪酶检测的稳定的荧光底物，因为它们与高碘酸盐和牛血清白蛋白发生二次反应。还已报道了使用4
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甲基伞形酮(MU)的终点和动力学测定法。最后，还已报道可商购获得的试剂盒(如EnzChekTM)对LPL具有高敏感度，并且可作为监测脂肪酶活性的有用工具。
[0005]蛋白质治疗剂溶液中存在的痕量水解酶可能难以检测。因此，需要用于快速高通量检测这些酶的改进方法。

技术实现思路

[0006]在各种实施例中，本公开涉及一种用于确定样品中的宿主细胞蛋白质(HCP)的酶活性的测定法，其中HCP包含水解酶，该测定法包括以下步骤：在微孔板中获得反应混合物，其中反应混合物包含：样品、反应缓冲液和作为荧光底物的4
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甲基伞形酮羧酸酯；获得阴性对照；将反应混合物和阴性对照暴露于荧光信号；监测由于暴露于荧光信号引起的反应混合物中的荧光底物从非荧光状态到荧光产物的转化，其中荧光产物为4
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甲基伞形酮(MU)；以及基于荧光底物的转化来确定和定量HCP酶活性。
[0007]在各种实施例中，样品包含两种或更多种不同的HCP。在各种实施例中，HCP酶活性代表样品中的两种或更多种HCP的总体活性。在各种实施例中，反应混合物包含至少两种不同的荧光底物。在各种实施例中，HCP包括酯酶。在各种实施例中，HCP包括羧酸酯水解酶，并且其中HCP任选地包括脂肪酶和羧酸酯酶。在各种实施例中，荧光底物具有8、10、12、16和/或18的碳链长度。在各种实施例中，荧光底物为辛酸4
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甲基伞形酮酯(MU
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C8)。在各种实施例中，荧光底物为癸酸4
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甲基伞形酮酯(MU
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C10)。
[0008]在各种实施例中，样品包含来自原核或真核宿主的产物。在各种实施例中，样品包含由原核或真核宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含由原核或真核宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含基于IgG形式并且由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含基于IgG形式并且由大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)宿主产生的重组蛋白。
[0009]在各种实施例中，样品包含选自由以下项组成的组的重组蛋白：IgG1 mAb、IgG4 mAb、双特异性抗体；由细菌宿主产生的mAb和由哺乳动物宿主产生的mAb。
[0010]在各种实施例中，阴性对照为酶空白。在各种实施例中，反应混合物中的荧光底物具有约0.1mM至5mM、约0.1mM至4mM、约0.1mM至3mM、约0.1mM至2mM或约0.5mM至1.0mM的浓度。在各种实施例中，样品为经过层析纯化的合并物样品。在各种实施例中，使用分别为300nm至400nm和400nm至500nm、任选地分别为约355nm和460nm的激发波长和发射波长，将样品暴露于增加的荧光信号下。在各种实施例中，孵育该样品任选地持续约1小时至5小时、约1小时至4小时、约1小时至3小时或约2小时。在各种实施例中，每5分钟至15分钟监测所述样品，或其中任选地每10分钟监测所述样品。在各种实施例中，反应混合物具有约4至9、约5至9、约6至9、约7至9或约8的pH。
[0011]在各种实施例中，酶活性用于评估样品中对聚山梨醇酯降解的水解活性水平。在各种实施例中，该测定法的输出用于比较和选择纯化工艺以改善水解HCP的去除。
[0012]在各种实施例中，本公开涉及一种用于确定样品中的宿主细胞蛋白质(HCP)的酶活性的测定法，其中HCP包含水解酶，并且该测定法包括以下步骤：(a)获得包含样品、反应缓冲液和荧光底物的反应混合物，其中荧光底物为4
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甲基伞形酮羧酸酯，其中4
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甲基伞形酮羧酸酯中的羧酸酯包含不超过十个碳；(b)在一个或多个时间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定样品中的宿主细胞蛋白质(HCP)的酶活性的测定法，其中所述HCP包含水解酶，所述测定法包括以下步骤：a)在微孔板中获得反应混合物，其中所述反应混合物包含：所述样品、反应缓冲液和作为荧光底物的4
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甲基伞形酮羧酸酯；b)获得阴性对照；c)将所述反应混合物和所述阴性对照暴露于荧光信号；d)监测由于暴露于所述荧光信号引起的所述反应混合物中的所述荧光底物从非荧光状态到荧光产物的转化，其中所述荧光产物为4
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甲基伞形酮(MU)；以及e)基于在步骤d)中所述荧光底物的转化来确定和定量HCP酶活性。2.根据权利要求1所述的测定法，其中所述样品包含两种或更多种不同的HCP。3.根据权利要求1或2所述的测定法，其中在步骤e)中的所述HCP酶活性代表所述样品中的两种或更多种HCP的总体活性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物包含至少两种不同的荧光底物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的测定法，其中所述HCP包括酯酶。6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中所述HCP包括羧酸酯水解酶，并且其中所述HCP任选地包括脂肪酶和羧酸酯酶。7.根据权利要求1至6中任一项所述的测定法，其中所述荧光底物具有8、10、12、16和/或18的碳链长度。8.根据权利要求1至6中任一项所述的测定法，其中所述荧光底物为辛酸4
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甲基伞形酮酯(MU
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C8)。9.根据权利要求1至6中任一项所述的测定法，其中所述荧光底物为癸酸4
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甲基伞形酮酯(MU
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C10)。10.根据权利要求1至9中任一项所述的测定法，其中所述样品包含来自原核或真核宿主的产物。11.根据权利要求1至10中任一项所述的测定法，其中所述样品包含由原核或真核宿主产生的重组蛋白。12.根据权利要求1至11中任一项所述的测定法，其中所述样品包含由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。13.根据权利要求1至12中任一项所述的测定法，其中所述样品包含基于IgG形式并且由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。14.根据权利要求1至13中任一项所述的测定法，其中所述样品包含基于IgG形式并且由大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)宿主产生的重组蛋白。15.根据权利要求1至14中任一项所述的测定法，其中所述样品包含选自由以下项组成的组的重组蛋白：IgG1 mAb、IgG4 mAb、双特异性抗体；由细菌宿主产生的mAb和由哺乳动物宿主产生的mAb。16.根据权利要求1至15中任一项所述的测定法，其中所述阴性对照为酶空白。17.根据权利要求1至16中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物中的所述荧光底物具有约0.1mM至5mM、约0.1mM至4mM、约0.1mM至3mM、约0.1mM至2mM或约0.5mM至1.0mM的浓
度。18.根据权利要求1至17中任一项所述的测定法，其中所述样品为经过层析纯化的合并物样品。19.根据权利要求1至18中任一项所述的测定法，其中在步骤b)中，使用分别为300nm至400nm和400nm至500nm、任选地分别为约355nm和460nm的激发波长和发射波长，将所述样品暴露于增加的荧光信号下。20.根据权利要求1至19中任一项所述的测定法，其中在步骤c)中，孵育所述样品任选地持续约1小时至5小时、约1小时至4小时、约1小时至3小时或约2小时。21.根据权利要求1至20中任一项所述的测定法，其中在步骤c)中，每5分钟至15分钟监测所述样品，或其中任选地每10分钟监测所述样品。22.根据权利要求1至21中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物具有约4至9、约5至9、约6至9、约7至9或约8的pH。23.根据权利要求1至22中任一项所述的测定法，其中所述酶活性用于评估所述样品中对聚山梨醇酯降解的水解活性水平。24.根据权利要求1至23中任一项所述的测定法，其中所述测定法的输出用于比较和选择纯化工艺以改善水解HCP的去除。25.一种用于确定样品中的宿主细胞蛋白质(HCP)的酶活性的测定法，其中所述HCP包含水解酶，并且所述测定法包括以下步骤：a)获得包含所述样品、反应缓冲液和荧光底物的反应混合物，其中所述荧光底物为4
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甲基伞形酮羧酸酯，其中所述4
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甲基伞形酮羧酸酯中的羧酸酯包含不超过十个碳；b)在一个或多个时间点测量所述荧光信号；以及c)基于测量的荧光确定和定量HCP酶活性。26.根据权利要求25所述的测定法，其中所述4
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甲基伞形酮羧酸酯中的所述羧酸酯包含不超过8个碳。27.根据权利要求25所述的测定法，其中所述4
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甲基伞形酮羧酸酯为MU
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C8。28.根据权利要求25所述的测定法，其中所述4
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：易吏，A，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：