一种检测样品中的蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测样品中的蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将所述样品与磁性纳米颗粒混合，得到结合有蛋白的磁性纳米颗粒；S2、将所述结合有蛋白的磁性纳米颗粒依次进行还原处理、烷基化处理、洗涤处理和酶切处理，得到酶切产物；S3、将所述酶切产物进行质谱检测；其中，所述磁性纳米颗粒包括四氧化三铁纳米颗粒和形成在所述四氧化三铁纳米颗粒上的共价有机骨架，所述共价有机骨架为1,3,5

【技术实现步骤摘要】
一种检测样品中的蛋白的方法


[0001]本申请涉及生物
，具体地，涉及一种检测样品中的蛋白的方法。

技术介绍

[0002]血浆是一种易于获取的微创样本，它记录了身体的实时状态，并将不同的生活方式、疾病、治疗或其他相关变化的综合结果直接反馈给检测者。血浆中除人血清白蛋白、载脂蛋白、凝血级联蛋白等功能蛋白外，还含有大量的组织渗漏蛋白、信号分子和细胞因子。血浆蛋白质组数据库(www.plasmaproteomedatabase.org)记录了大约10546种蛋白质。血浆蛋白质组研究对于疾病诊断、风险预测、预后监测和治疗效果评估的生物标志物开发至关重要。
[0003]在过去的几年中，有大量的研究致力于从血浆样本中寻找与疾病相关的生物标志物。有人分析了血浆和肝脏活检的蛋白质组学，以找到预测未来相关事件和酒精相关肝病死亡率的生物标志物。还有人采用了高通量、无偏倚的定量蛋白质组学来探讨血浆蛋白水平与亚临床动脉粥样硬化之间的关系。对于神经障碍患者来说，在脑脊液和脑组织样本难以获得的情况下，血浆蛋白生物标志物的发现尤为重要。还有人试图通过分析阿尔茨海默病的血浆蛋白质组来开发生物标志物。但由于蛋白质组学深度不足，进展有限。
[0004]血浆样品的高丰度蛋白抑制作用使得在ng/ml水平上探测血浆生物标志物非常困难。为了提高低丰度蛋白的可检测性，已经建立了各种前处理策略，包括基于免疫或亲和的高丰度去除方法、液相分离法和亚蛋白质组富集法。在已有的研究中，通过高pH的RPLC分离和LC
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MS/MS分析，鉴定了1544个血浆蛋白和258个新蛋白。
[0005]尽管蛋白质组学的深度有所增加，但该策略不能满足临床样本高通量分析的需求。
[0006]纳米材料用于携带药物进入身体的目标区域进行诊断或治疗，已发现纳米材料在进入生物环境时，会在其表面吸附多层蛋白质，形成蛋白质冠。纳米材料与血浆相互作用，形成蛋白冠。高丰度蛋白最初与纳米材料表面结合，随后被高亲和力的低丰度蛋白取代(Vroman效应)。蛋白冠可以缩小蛋白浓度的动态范围，富集低丰度和中丰度蛋白，增加血浆蛋白的检测深度。
[0007]近年来，来自材料领域的大量研究表明，具有不同修饰基团，不同基质的纳米材料具有不同的蛋白电晕特性。有人通过对蛋白冠的表征，确定了一组在乳腺癌和前列腺癌患者及对照组中表现出显著差异的蛋白质。虽然利用纳米材料可以用于进行疾病蛋白质组学研究，但其在临床蛋白质组学应用中的定性深度、定量稳定性、可靠性和时间效率仍然需要提高。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提高纳米材料在临床蛋白质组学应用中的定性深度、定量稳定性、可靠性和时间效率。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种检测样品中的蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将所述样品与磁性纳米颗粒混合，得到结合有蛋白的磁性纳米颗粒；S2、将所述结合有蛋白的磁性纳米颗粒依次进行还原处理、烷基化处理、洗涤处理和酶切处理，得到酶切产物；S3、将所述酶切产物进行质谱检测；其中，所述磁性纳米颗粒包括四氧化三铁纳米颗粒和形成在所述四氧化三铁纳米颗粒上的共价有机骨架，所述共价有机骨架为1,3,5
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三甲酰间苯二酚和1,4
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二氨基苯反应得到的共价有机骨架。
[0010]通过上述技术方案，本专利技术提高了纳米材料在临床蛋白质组学应用中的定性深度、定量稳定性、可靠性和时间效率。
[0011]本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
[0012]附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0013]图1是DMB珠的TEM图像。
[0014]图2是同样的血浆经高丰度蛋白去除(2和14个高丰度蛋白去除)、六肽配体富集和DMB珠富集处理后得到的鉴定蛋白质结果图。
[0015]图3是DMB珠对浓度在μg/L和ng/L范围内的蛋白质的富集能力(蛋白质鉴定种类)的测试结果图。
[0016]图4是DMB珠富集蛋白质(对比理论丰度)的测试结果图。
[0017]图5是不同酶切时间下，DMB珠磁珠上酶切和溶液酶切相比的蛋白质鉴定的数量。
[0018]图6是血浆蛋白定量结果比较，横轴为大肠杆菌蛋白梯度量，纵轴为人血浆蛋白定量的倍数变化。
[0019]图7是大肠杆菌蛋白定量结果比较，横轴为大肠杆菌蛋白梯度量，纵轴为大肠杆菌蛋白定量的倍数变化。
[0020]图8是DMB珠和文献报道的耗材对蛋白检出数量的影响。
具体实施方式
[0021]以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0022]本专利技术提供了一种检测样品中的蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将所述样品与磁性纳米颗粒混合，得到结合有蛋白的磁性纳米颗粒；S2、将所述结合有蛋白的磁性纳米颗粒依次进行还原处理、烷基化处理、洗涤处理和酶切处理，得到酶切产物；S3、将所述酶切产物进行质谱检测；其中，所述磁性纳米颗粒包括四氧化三铁纳米颗粒和形成在所述四氧化三铁纳米颗粒上的共价有机骨架，所述共价有机骨架为1,3,5
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三甲酰间苯二酚和1,4
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二氨基苯反应得到的共价有机骨架。
[0023]可选地，其中，所述磁性纳米颗粒的粒径为0.1
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0.3μm。
[0024]可选地，其中，在所述磁性纳米颗粒中，相对于每重量份的所述四氧化三铁纳米颗粒，所述共价有机骨架的含量为2
‑
4重量份。
[0025]可选地，其中，该方法还包括通过如下步骤制备所述磁性纳米颗粒：SS1、将六水合
三氯化铁和乙酸钠在乙二醇中溶解，得到均相透明溶液；六水合三氯化铁和乙酸钠的重量比为1:2
‑
5；相对于1g三氯化铁，乙二醇的用量为15
‑
25mL；SS2、将所述均相透明溶液在150
‑
250℃下进行4
‑
24小时的第一溶剂热反应，得到黑色粉末；SS3、将所述黑色粉末、1,3,5
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三甲酰间苯二酚和1,4
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二氨基苯以1：1
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2：1
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2的重量比在乙醇中混合，并在150
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250℃下进行20
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80小时的第二溶剂热反应；相对于1g所述黑色粉末，乙醇的用量为15
‑
25mL。
[0026]可选地，其中，所述样品为全血、血浆、血清或脑脊液。
[0027]可选地，其中，所述样品在稀释1
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3倍后与所述磁性纳米颗粒混合。
[0028]可选地，其中，相对于1mL稀释后的样品，所述磁性纳米颗粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测样品中的蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：S1、将所述样品与磁性纳米颗粒混合，得到结合有蛋白的磁性纳米颗粒；S2、将所述结合有蛋白的磁性纳米颗粒依次进行还原处理、烷基化处理、洗涤处理和酶切处理，得到酶切产物；S3、将所述酶切产物进行质谱检测；其中，所述磁性纳米颗粒包括四氧化三铁纳米颗粒和形成在所述四氧化三铁纳米颗粒上的共价有机骨架，所述共价有机骨架为1,3,5
‑
三甲酰间苯二酚和1,4
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二氨基苯反应得到的共价有机骨架。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磁性纳米颗粒的粒径为0.1～0.3μm。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述磁性纳米颗粒中，相对于每重量份的所述四氧化三铁纳米颗粒，所述共价有机骨架的含量为2～4重量份。4.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括通过如下步骤制备所述磁性纳米颗粒：SS1、将六水合三氯化铁和乙酸钠在乙二醇中溶解，得到均相透明溶液；六水合三氯化铁和乙酸钠的重量比为1:2
‑
5；相对于1g三氯化铁，乙二醇的用量为15～25mL；SS2、将所述均相透明溶液在150
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250℃下进行4
‑
24小时的第一溶剂热反应，得到黑色粉末；SS3、将所述黑色粉末、1,3,5
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三甲酰间苯二酚和1,4
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二氨基苯以1：1
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2：1
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙龙钦，赵焱，李京丽，吴松锋，
申请(专利权)人：北京青莲百奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：