【技术实现步骤摘要】
一株羊肠道病毒的分离鉴定方法及应用
[0001]本专利技术涉及病毒分离鉴定备
,尤其涉及一株羊肠道病毒的分离鉴定方法及应用。
技术介绍
[0002]羊肠道病毒(CaprineEnterovirus,CEV)属于小RNA病毒科肠道病毒属成员,是一种羊的新发传染病病原体。在临床上以消化道和呼吸道症状为主要特征,某些发病羊群呈现严重腹泻、高热、流涎,甚至造成繁殖障碍。该病毒是匈牙利学者于2012年首次从健康绵羊的粪便中测定了TB4
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OEV株的基因组序列,2014年日本学者仅从腹泻山羊粪便内检测到CEV基因序列,2016年泰国也从腹泻山羊上检测到CEV基因序列,但是均未分离到病毒。2014年,王明月等从腹泻山羊病例中,利用山羊腹泻粪便接种Vero细胞的方法分离出肠道病毒CEV
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JL14,首次确认了羊群中存在的肠道病毒感染;后续利用同样方法分离出的病毒株包括:2020年,王汝都等人分离鉴定的HeN
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D1
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37、HeN
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D2
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57、ZK/2018株;林倩等人(2020)分离的6株山羊肠道病毒JL
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LS34、JL
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LS127、JL
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LS165、JI
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LS174、NMG
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F37、SD
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S68和1株绵羊肠道病毒NX
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DR26,其中NX
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DR26为国内分离 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一株羊肠道病毒的分离鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1:组织样品处理及核酸提取,将采取的死亡羊少许淋巴组织和肠道组织混合研磨,加入适量灭菌石英砂充分研磨,用0.01mol/LPBS溶液、pH值7.4,制成1:3
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1:5悬液,反复冻融3次,8000rpm离心10min,取上清液提取核酸;步骤2:RT
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PCR扩增,以提取的病毒基因组RNA为模板,使用实验室常用检测小反刍兽疫病毒PPRV、口蹄疫病毒FMDV和牛病毒性腹泻病毒BVDV的PCR引物进行RT
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PCR扩增,扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,按照DNA片段胶回收试剂盒纯化回收目的条带,将纯化产物使用扩增引物进行测序;步骤3:病毒分离,利用RNA转染易感细胞的方法分离病毒;步骤4:测序鉴定,待细胞出现明显病变后,取第3代细胞培养物和原始组织研磨物各1mL,各加入2mL的Trizol溶液,混匀密封,低温条件下寄送测序公司进行宏基因组测序;步骤5:序列比对分析,将测定的病毒全长与家畜肠道病毒各亚种的代表毒株序列建立遗传演化系统进化发生树,确定测定的毒株序列。2.根据权利要求1所述的一株羊肠道病毒的分离鉴定方法,其特征在于,所述步骤1中按照TotalRNAKitI的说明书提取RNA,其中TotalRNAKitI购自OmegaBIO
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TEK公司。3.根据权利要求1所述的一株羊肠道病毒的分离鉴定方法,其特征在于,所述步骤2中PCR反应体系为:2
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OnestepMix12.5μl,上下游引物(10mM)各1.5μl,OnestepEnzymeMix1μl,模板RNA3μl,灭菌蒸馏水5.5μl,总反应体系25μl;反应条件为:50℃30min,94℃3min;94℃30sec,57℃30sec,72℃1min,共35个循环;最后72℃5min。4.根据权利要求1所述的一株羊肠道病毒的分离鉴定方法,其特征在于,所述步骤2中测序委托北京擎科新业生物技术有限公司完成。5.根据权利要求1所述的一株羊肠道病毒的分离鉴定方法,其特征在于,所述步骤3中RN...
【专利技术属性】
技术研发人员:孙普,李平花,卢曾军,魏达礼,马雪青,丁凯璐,张婧,付元芳,袁红,赵志荀,白兴文,李坤,刘在新,
申请(专利权)人:中国农业科学院兰州兽医研究所,
类型:发明
国别省市:
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