本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用。本发明专利技术的重组人纤连蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术重组人纤连蛋白的基因序列经过密码子优化，构建重组质粒后采用大肠杆菌表达系统表达，表达的重组人纤连蛋白表达量高达33.6％，具有完整的纤连蛋白结构与功能，能有效促进细胞粘附、增殖和迁移；可在食品、化妆品、保健品、药械等领域应用。本发明专利技术的提供的重组人纤连蛋白的制备方法基因序列稳定，表达量高，且制备的重组人纤连蛋白生物学活性高、纯度高。度高。度高。
【技术实现步骤摘要】
一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用
[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种在血液、间质外基质和细胞周基质中发现的关键黏附蛋白，是一种大分子糖蛋白，其分子量大约是440KD，由几乎两个相同的单体通过C末端二硫键相连。主要包括三种类型：I型、II型、III型。其中I型和II型含有链内二硫键，III型不含二硫键，使其在外力作用下可以部分展开。纤连蛋白的主要功能是增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连，在调节细胞粘附、迁移、增殖等过程中发挥重要作用。
[0003]目前，纤连蛋白大多数是动物的血液或组织中提取的天然的纤连蛋白，其产量有限、成本昂贵，限制了纤连蛋白的生产和其在医疗、美容方面的应用。由于纤连蛋白的分子量太大(由2000多个氨基酸组成)，难以被皮肤吸收。
[0004]因此，利用基因工程技术构建出与天然纤连蛋白在功能上相似的小分子重组纤连蛋白，以克服天然纤连蛋白分子过大难以生产的缺点，同时还兼顾纤连蛋白活性，降低生产成本，成为研发的重要方向之一。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种重组人纤连蛋白，所述人纤连蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]本专利技术重组人纤连蛋白的基因序列经过密码子优化，构建重组质粒后采用大肠杆菌表达系统表达，表达的重组人纤连蛋白为可溶性表达，表达量高达33.6％，无蛋白纯化标签，对蛋白功能和结构无影响，具有完整的纤连蛋白结构与功能，能有效促进细胞粘附、增殖和迁移。重组人纤连蛋白具有较高生物学活性。可在食品、化妆品、保健品、药械等领域应用。
[0009]第二方面，本专利技术提供了一种人纤连蛋白的重组质粒，所述质粒包含所述的重组人纤连蛋白的核苷酸序列。
[0010]第三方面，本专利技术提供了一种重组人纤连蛋白的高产宿主菌，所述高产宿主菌包含所述的重组质粒。
[0011]本专利技术的组人纤连蛋白的高产宿主菌表达量高达50％～70％。
[0012]作为本专利技术所述的高产宿主菌的优选实施方式，所述高产宿主菌为大肠杆菌。
[0013]第四方面，本专利技术提供了一种重组人纤连蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0014](1)取所述的高产宿主菌发酵培养，得发酵液；
[0015](2)离心所得发酵液收集菌体，用裂解液重悬菌体，得菌悬液；
[0016](3)破碎所得菌悬液，0℃～4℃条件下离心收集上清；
[0017](4)过滤收集的上清，得重组人纤连蛋白。
[0018]本专利技术的制备方法制备方便、纯化过程简单、成本较低，生产周期较短。蛋白纯度到达99％，且内毒素含量小于等于1EU/μg。制备方法基因序列稳定，表达量高，且制备的重组人纤连蛋白生物学活性高、纯度高。
[0019]作为本专利技术所述的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述发酵的基础培养基包括：蛋白胨15g/L～30g/L，酵母粉10g/L～15g/L，葡萄糖5g/L～20g/L，磷酸二氢钾2.0g/L～2.5g/L，磷酸氢二钾15g/L～16g/L，硫酸镁1.5g/L～2.5g/L，氯化锌0.08g/L～0.12g/L，硫酸锰0.08mg/L～0.12mg/L，钼酸钠0.08mg/L～0.12mg/L，氯化钙0.08mg/L～0.12mg/L。
[0020]作为本专利技术所述的的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述发酵的补料培养基包括补料A和补料B；所述补料A包括：蛋白胨100g/L～220g/L和酵母粉80g/L～120g/L；所述补料B包括：葡萄糖450g/L～650g/L和硫酸镁8g/L～12g/L；所述补料采用非反馈指数流加补料，起始补料速度为8mL/h～12mL/h，按指数梯度增加，每小时增加8mL～12mL。
[0021]作为本专利技术所述的的制备方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述裂解液包括15mM～25mM的tris和15mM～25mM的pbs；所述菌体和裂解液的质量体积比为1:(8～10)。
[0022]第五方面，本专利技术提供了一种美容组合物，包含所述的制备方法制备的重组人纤连蛋白。
[0023]第六方面，本专利技术将所述重组人纤连蛋白、所述重组质粒、所述高产宿主菌、所述制备方法、所述组合物在食品、化妆品、保健品或药械领域中应用。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0025]本专利技术重组人纤连蛋白的基因序列经过密码子优化，构建重组质粒后采用大肠杆菌表达系统表达，表达的重组人纤连蛋白为可溶性表达，表达量高，无蛋白纯化标签，对蛋白功能和结构无影响。重组人纤连蛋白具有较高生物学活性，当细胞加入纤维连接蛋白包被板37℃下培养35分钟后，约35％～60％的细胞具有特异性粘附。
[0026]本专利技术的制备方法制备方便、纯化过程简单、成本较低，生产周期较短。蛋白纯度到达99％，且内毒素含量小于等于1EU/μg。
附图说明
[0027]图1为重组质粒pET
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32a
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rHuFn的质粒图谱。
[0028]图2为重组质粒pET
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rHuFn的酶切验证电泳图；
[0029]图2中，Lane M:DNA Marker；Lane 1:Plasmid digested by EcoR I and Apa I；Lane 2:Uncut plasmid DNA。
[0030]图3为重组质粒pET
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32a
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rHuFn
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2的质粒图谱。
[0031]图4为重组质粒pET
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32a
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rHuFn
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2的酶切验证电泳图；
[0032]图4中，Lane M:DNA Marker；Lane 1:Plasmid digested by Bgl II and Xho I；Lane 2:Uncut plasmid DNA。
[0033]图5为实施例3样品的SDS
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PAGE电泳图；
[0034]图5中，M：Marker；1：pET
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rHuFn诱导前；2：pET
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rHuFn诱导全菌；3：pET
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rHuFn诱导上清；4：pET
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rHuFn诱导沉淀；5：pET
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rHuFn
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2诱导前；6：pET
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组人纤连蛋白，其特征在于，所述人纤连蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种人纤连蛋白的重组质粒，其特征在于，所述质粒包含权利要求1所述的重组人纤连蛋白的核苷酸序列。3.一种重组人纤连蛋白的高产宿主菌，其特征在于，所述高产宿主菌包含权利要求2所述的重组质粒。4.根据权利要求3所述的高产宿主菌，其特征在于，所述高产宿主菌为大肠杆菌。5.一种重组人纤连蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取权利要求3所述的高产宿主菌发酵培养，得发酵液；(2)离心所得发酵液收集菌体，用裂解液重悬菌体，得菌悬液；(3)破碎所得菌悬液，0℃～4℃条件下离心收集上清；(4)过滤收集的上清，得重组人纤连蛋白。6.根据权利要求5所述的的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述发酵的基础培养基包括：蛋白胨15g/L～30g/L，酵母粉10g/L～15g/L，葡萄糖5g/L～20g/L，磷酸二氢钾2.0g/L～2.5g/L，磷酸氢二钾15g/L～16g/L，硫酸镁1.5g/L～2.5g/L，氯化锌0.08g/L～0.12g/L，硫酸锰0.08mg/L～0.12m...
【专利技术属性】
技术研发人员：周晗，陈宁，赖云，颜福霞，杨蒙蒙，邹衡芳，陈玉容，
申请(专利权)人：广州远想医学生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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