用于治疗纤维化的内皮抑素片段和变体制造技术

本申请涉及用于治疗纤维化的内皮抑素片段和变体。本文中描述了使用含有内皮抑素的片段和变体的多肽治疗纤维化的材料和方法。段和变体的多肽治疗纤维化的材料和方法。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗纤维化的内皮抑素片段和变体
[0001]本申请是申请日为2016年6月3日、申请号为“201680044858.5”、名称为“用于治疗纤维化的内皮抑素片段和变体”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2015年6月5日提交的美国临时申请第62/171,889号和2015年11月19日提交的美国临时申请第62/257,607号的优先权。


[0004]本文件涉及用于治疗纤维化的材料和方法，并且具体来说，涉及含有内皮抑素的片段和变体的多肽用于治疗纤维化的用途。

技术介绍

[0005]内皮抑素，一种对应于胶原蛋白18的C端的183个氨基酸的蛋白水解切割片段，具有抗肿瘤活性而没有毒性副作用(奥莱利(O'Reilly)等人(1997)细胞(Cell),88:277
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285；基斯克尔(Kisker)等人(2001)癌症研究(Cancer Res),61:7669
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7674；达汗巴尔(Dhanabal)等人(1999)癌症研究,59:189
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197；尹(Yoon)等人(1999)癌症研究,59:6251
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6256；佛克曼(Folkman)和卡卢里(Kalluri),(2003)癌症医学(Cancer Medicine),第6版,第161
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194页.哈密尔顿：B.C.德克尔公司(Hamilton:B.C.Decker Inc.))。已经报道了这种蛋白质的许多抗血管生成活性，例如抑制内皮细胞增殖、迁移和小管形成。这种活性已经定位于内皮抑素的N端区。内皮抑素还抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管通透性(高桥(Takahashi)等人(2003)美国实验生物学会联合会杂志(Faseb J),17:896
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898)。内皮抑素通过结合于α5β1整合素抑制粘附斑激酶的磷酸化来抑制内皮细胞迁移(威克斯特龙(Wickstrom)等人(2002)癌症研究,62:5580
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5589)。也已经表明，细胞表面磷脂酰肌醇蛋白聚糖是低亲和力的内皮抑素受体(卡鲁曼希(Karumanchi)等人(2001)分子细胞(Mol Cell),7:811
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822)。内皮抑素已牵涉数个信号传导途径，如下调c
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myc(七里(Shichiri)和平田(Hirata)(2001)美国实验生物学会联合会杂志,15:1044
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1053)、细胞周期素
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D1(花井(Hanai)等人(2002)生物化学杂志(J Biol Chem),277.16464
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16469)和RhoA活性(威克斯特龙等人(2003)生物化学杂志,278:37895
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37901)、阻断VEGF信号传导(哈吉斗(Hajitou)等人(2002)美国实验生物学会联合会杂志,16:1802
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1804；金(Kim)等人(2002)生物化学杂志,277:27872
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27879)和抑制wnt信号传导路径(花井等人(2002)细胞生物学杂志(J Cell Biol),158:529
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539)。另外，已显示内皮抑素结合金属蛋白酶并使其失活(金等人(2000)癌症研究,60:5410
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5413；尼贝里(Nyberg)等人(2003)生物化学杂志,278:22404
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22411；李(Lee)等人(2002)欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett),519:147
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152)并调节抑制血管生成的基因谱(阿卜杜拉汗(Abdollahi)等人(2004)分子细胞,13:649
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663)。
[0006]已经拆分了鼠类和人类内皮抑素的晶体结构(霍恩内斯特(Hohenester)等人(1998)欧洲分子生物学杂志(Embo J),17:1656
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1664；丁(Ding)等人(1998)美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA),95:10443
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10448)，并且显示了在结晶所需的高浓度下
非共价保留的二聚体(丁等人(1998)美国国家科学院院刊,95:10443
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10448)。两个二硫键的存在产生高度折叠的结构。内皮抑素通过分子N端的三个组氨酸(组氨酸1、3和11)和天冬氨酸76结合每个单体的一个锌原子。内皮抑素的肝素结合特性由聚集在分子的三维球状表面上的不连续的精氨酸介导(佐佐木(Sasaki)等人(1999)欧洲分子生物学杂志,18:6240
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6248)。
[0007]由器官成纤维细胞过度沉积细胞外基质(ECM)组分，如纤连蛋白(FN)和I型胶原蛋白(Collα1)，被定义为纤维化。器官纤维化是导致末期器官衰竭的许多疾病的最后共同途径。然而，针对器官纤维化的有效疗法仍然不可用(参见例如波拉克(Bjoraker)等人,美国呼吸与重症护理医学杂志(Am.J.Respir.Crit.Care.Med)2000；157:199
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203)。不可控制的伤口愈合反应，包括急性和慢性炎症、血管生成、驻留细胞的活化和ECM重塑，被认为涉及纤维化的发病机理(温(Wynn),临床研究杂志(J Clin Invest)2007；117:524
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29；卡卢里等人,肾病学与高血压现代观点(Curr Opin Nephrol Hypertension)2000；9:413
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8)。TGF
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β是在纤维化器官中增加的原型纤维化细胞因子，并且通过刺激ECM分子的合成、将成纤维细胞活化成表达α
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平滑肌肌动蛋白(α
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SMA)的肌成纤维细胞并且下调基质金属蛋白酶(MMP)而促成纤维化的发展(参见例如布瑞腾(Branton)等人,微生物与感染(Microbes Infect)1999；1:1349
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65)。尽管期望很高，单克隆抗TGF
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β抗体在早期系统性硬化症(SSc)患者中的临床试验未能显示出任何疗效(瓦尔加(Varga)等人,自然评论风湿病学(Nature Reviews Rheumatology)2009；5:200
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6)。因此，仍然需要其它的纤维化治疗。

技术实现思路

[0008]本文件至少部分基于开发具有抗纤维化活性的C端内皮抑素片段及其变体，以及开发在植物中产生这种片段和变体的方法和使用所述片段和变体治疗有需要的个体的纤维化的方法。
[0009]本文件还至少部分基于以下发现：将含有内皮抑素的E3区(例如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:13的氨基酸133
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180)的基于内皮抑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种经分离的多肽，其中所述多肽：a)包含SEQ ID NO:14；以及b)当投与有需要的个体时具有抗纤维化活性。2.根据权利要求1所述的经分离的多肽，另外包含分泌序列。3.根据权利要求1所述的经分离的多肽，另外包含肽标签。4.根据权利要求3所述的经分离的多肽，其中所述肽标签是6His标签。5.根据权利要求3所述的经分离的多肽，其中所述肽标签包含KDEL多肽。6.根据权利要求1所述的经分离的多肽，其中所述多肽另外包含在SEQ ID NO:14的C端的Ala
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Ser
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Lys序列。7.根据权利要求1所述的经分离的多肽，另外包含IgG Fc结构域。8.根据权利要求7所述的经分离的多肽，其中所述IgG Fc结构域是IgG1 Fc结构域。9.根据权利要求8所述的经分离的多肽，其中所述IgG1 Fc结构域是人类IgG1 Fc结构域。10.根据权利要求1所述的经分离的多肽，另外包含SEQ ID NO:17的氨基酸27至43。11.根据权利要求1所述的经分离的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:16。12.根据权利要求1所述的经分离的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:17。13.一种经分离的多肽，其中所述多肽：(a)包含SEQ ID NO:2的氨基酸133至180或SEQ ID NO:13的氨基酸133至180，和以下中的一或多个：(i)肽标签；(ii)KDEL(SEQ ID NO:19)序列；和(iii)SEQ ID NO:17的氨基酸27至43；以及(b)当投与有需要的个体时具有抗纤维化活性。14.根据权利要求13所述的经分离的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:15。15.一种编码根据权利要求1或权利要求13所述的多肽的经分离的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸可操作地连接于异源启动子。16.一种表达载体，包含根据权利要求15所述的经分离的聚核苷酸。17.根据权利要求16所述的表达载体，其中所述载体是启动载体。18.根据权利要求17所述的表达载体，其中所述启动载体是病毒载体。19.一种根癌农杆菌细胞，包含根据权利要求16所述的表达载体。20...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：诺维奇生物科技有限责任公司MUSC研究发展基金会，
类型：发明
国别省市：