一种用于无损鉴别西洋参和人参的引物、试剂盒及鉴别方法技术

本发明专利技术公开了一种用于无损鉴别西洋参和人参的引物、试剂盒及鉴别方法，主要涉及药用植物种属鉴定技术领域。引物包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1所示的正向引物PF和核苷酸序列如序列表SEQ ID No：2所示的反向引物PR。本发明专利技术的有益效果在于：利用一对引物对人参和西洋参进行鉴定，既不需要对反应体系进行优化，也不需要严格的PCR反应条件，结果可通过熔解曲线的特征峰或扩增产物的Tm值明显地将人参和西洋参区分开，从而可达到田间快速、无损、高通量筛选鉴别人参和西洋参的目的。高通量筛选鉴别人参和西洋参的目的。高通量筛选鉴别人参和西洋参的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种用于无损鉴别西洋参和人参的引物、试剂盒及鉴别方法


[0001]本专利技术涉及药用植物种属鉴定
，具体是一种用于无损鉴别西洋参和人参的引物、试剂盒及鉴别方法。

技术介绍

[0002]西洋参和人参均为五加科多年生草本植物，是人参属中应用最广泛的两种药用植物。山东威海文登是我国西洋参的主产区，西洋参种植面积6万多亩。人参在我国分布于辽宁东部、吉林东半部和黑龙江东部，栽培面积和产量约占世界的70％，其中林下山参和园参是目前人参的两种主要类型。由于人参和西洋参的植物性状相似，生产用种存在一定的混杂，在田间的西洋参或人参均有一定程度的掺杂现象存在。虽人参和西洋参的植物形态和化学成分具有一定的相似性，但由于皂苷种类和含量的不同，二者具有不同药理功效。《中华人民共和国药典》中描述它们的药性和功效有显著差别：西洋参性凉，功效补气养阴，清热生津；人参性微温，功效大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津，安神。西洋参和人参不能混淆使用，因此开发一种可以用于田间西洋参和人参快速无损鉴别的方法对保护人参和西洋参产品品质、保障公众健康具有至关重要的作用。
[0003]传统的鉴别人参与西洋参方法包括化学法和光谱法等，但此类方法需对样品的特征化合物进行提取分离，在鉴别的同时也损坏了样品本身，不适用于田间的快速筛选和鉴别。
[0004]近年来，针对人参与西洋参的鉴别也开发了一系列的DNA分子标记技术，如DNA条形码，多重位点特异性PCR等。利用DNA条形码鉴别时，每次均需要对待测样品进行条形码的扩增、测序和聚类分析；多重位点特异性PCR则是利用人参和西洋参的多个SNP位点设计两对或两对以上的引物来扩增不同的目标基因片段进行多重PCR鉴别。但物种特异性引物需额外引入错配碱基，并且需要对PCR反应体系的温度和引物浓度进行优化才能保证鉴别结果的准确性。由于上述方法本身的限制，无法用于在田间对大规模的西洋参和人参进行快速鉴别和筛选。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种用于无损鉴别西洋参和人参的引物、试剂盒及鉴别方法，它可达到田间快速、无损、高通量筛选鉴别人参和西洋参的目的。
[0006]本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
[0007]一种用于无损鉴别西洋参和人参的引物，包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1所示的正向引物PF和核苷酸序列如序列表SEQ ID No：2所示的反向引物PR。
[0008]所述正向引物PF为基于人参的特异性插入序列的前侧侧翼序列获得，所述反向引物PR为基于人参的特异性插入序列的后侧侧翼序列获得，所述人参的特异性插入序列长度为365bp且其核苷酸序列如序列表SEQ ID No：5所示。
[0009]作为本专利技术的另一个方面，一种试剂盒，所述试剂盒内采用的引物为如权利要求1
或2所述的正向引物PF和反向引物PR。
[0010]所述试剂盒包括1μL引物PF，1μL引物PR，2μL灭菌超纯水，5μL SYBR Green预混液，所述SYBR Green预混液通过1μL 10
×
EasyTaq buffer，0.8μL 2.5mM dNTPs，0.2μL EasyTaq DNA polymerase,0.5μL SYBR Green I,2.5μL H2O混合配得，所述试剂盒用于对1μL待测DNA样品进行鉴别。
[0011]作为本专利技术的另一个方面，一种鉴别方法，使用如权利要求1所述的引物，对待测DNA样品进行PCR扩增，如果扩增产物熔解曲线特征峰的Tm值为80.5℃，则样品为人参，如果特征峰的Tm值为76.5℃，则样品为西洋参。
[0012]所采用的10μL荧光定量PCR反应体系为：1μL待测样品的基因组DNA，1μL引物PF，1μL引物PR，2μL灭菌超纯水，5μL SYBR Green预混液，所述SYBR Green预混液通过1μL 10
×
EasyTaq buffer，0.8μL 2.5mM dNTPs，0.2μL EasyTaq DNA polymerase,0.5μL SYBR Green I,2.5μL H2O混合配得。
[0013]所述荧光定量PCR反应参数为：先95℃预变性15min；然后95℃10s，58℃10s，72℃20s，共40个循环；扩增循环结束后，降温至65℃，然后加热升温至95℃变性DNA产物。
[0014]所述待测样品DNA的提取方法包括：取目标植物新鲜叶片放于1.5mL的eppendorf管中，加入50μL 0.5mol/L的NaOH溶液，加入灭菌的钢珠后用高通量组织研磨器常温下振荡研磨30s，取5μL混合液移入含295μL的Tris
‑
HCl缓冲液中，所述缓冲液的pH为8.0，用移液枪吹打混匀即得到DNA样品。
[0015]对比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0016]基于本专利技术的引物，对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，由于人参的目的产物序列比西洋参目的产物序列长375bp，人参扩增产物的Tm值高于西洋参扩增产物，因此二者熔解曲线的特征峰不同，从而根据熔解曲线的特征峰或扩增产物的Tm值可以明显地将人参和西洋参区分开。
[0017]通过本技术，可达到快速、准确鉴定田间西洋参和人参植株的目的。虽然DNA条形码、多重位点特异性PCR等技术也可也鉴别人参与西洋参，但DNA条形码每次均需要对待测样品进行扩增、测序和聚类分析；多重位点特异性PCR需要两对或两对以上的引物来扩增不同的目标基因片段，需要对PCR反应体系的温度和引物浓度进行优化才能保证鉴别结果的可靠性和准确性。因此本专利技术的创造性在于仅利用一对引物对人参和西洋参进行鉴定，既不需要对反应体系进行优化，也不需要严格的PCR反应条件。此外，本方法对待测样品的DNA纯度要求低，可以采用简易法对少量人参或西洋参叶片提取DNA，无需破坏人参或西洋参根。结果可通过熔解曲线的特征峰或扩增产物的Tm值明显地将人参和西洋参区分开，从而达到对田间西洋参和人参进行快速无损鉴别的目的。
附图说明
[0018]图1为西洋参和人参鉴别专用引物的相对位置图。
[0019]图2为西洋参和人参普通PCR鉴定结果的凝胶电泳图。
[0020]图3为西洋参和人参荧光定量PCR鉴定结果的熔解曲线图。
[0021]图4是DNA简易提取的操作过程。
具体实施方式
[0022]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。
[0023]实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于无损鉴别西洋参和人参的引物，其特征在于，包括核苷酸序列如序列表SEQ ID No：1所示的正向引物PF和核苷酸序列如序列表SEQ ID No：2所示的反向引物PR。2.根据权利要求1所述的一种用于无损鉴别西洋参和人参的引物，其特征在于，所述正向引物PF为基于人参的特异性插入序列的前侧侧翼序列获得，所述反向引物PR为基于人参的特异性插入序列的后侧侧翼序列获得，所述人参的特异性插入序列长度为365bp且其核苷酸序列如序列表SEQ ID No：5所示。3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内采用的引物为如权利要求1或2所述的正向引物PF和反向引物PR。4.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1μL引物PF，1μL引物PR，2μL灭菌超纯水，5μL SYBR Green预混液，所述SYBR Green预混液通过1μL 10
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EasyTaq buffer，0.8μL 2.5mM dNTPs，0.2μL EasyTaq DNA polymerase,0.5μL SYBR Green I,2.5μL H2O混合配得，所述试剂盒用于对1μL待测DNA样品进行鉴别。5.一种鉴别方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的引物，对待测DNA样品进行PCR扩增，如果扩增产物熔解曲线特征峰的Tm值为80.5℃，则样...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪涛，江雨欣，张旭，林孟晨，
申请(专利权)人：烟台大学，
类型：发明
国别省市：