一种桑树桑黄菌种的分子标记引物及分子标记鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种桑树桑黄菌种的分子标记引物及分子标记鉴定方法，所述分子标记引物在所述桑树桑黄QJF

【技术实现步骤摘要】
一种桑树桑黄菌种的分子标记引物及分子标记鉴定方法


[0001]本专利技术属于分子标记
，具体涉及一种桑树桑黄菌种的分子标记引物及分子标记鉴定方法。

技术介绍

[0002]桑树桑黄(Sanghuangporus sanghuang)，隶属于担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、锈革孔菌目Hymenochaetales、锈革孔菌科Hymenochaetaceae、桑黄属Sanghuangporus，是生长在在鸡桑的活立木或半活立木，偶尔也生长在家桑活立木上的一种珍稀药用真菌。分布于中国暖温带和温带多个省区省市，以及韩国、日本和缅甸。关于桑黄的药用功能历代本草著作中均有详细记载，药用价值很高，具有抗菌、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗炎、抗痛风、抗皱、抗黑色素等活性，尤其在抗肿瘤方面，是目前真菌中抑制肿瘤细胞效果最好的真菌类活性物质，显著优于灵芝及香菇多糖，是未来抗癌药物的重要研发方向之一。已成为国内外医药制剂和保健品研究开发的热点，具有较好的经济效益和社会效益。
[0003]目前在市场上生产和销售的品种主要为杨树桑黄和粗毛纤孔菌等，形状外观与桑树桑黄相似很难区分。一般的传统分子标记ISSR，RAPD或者分子鉴定技术如扩增菌株ITS等在桑黄物种间的区分效率较低，更无法用于品种的区分。随着基因组测序技术的发展，越来越多的个体基因组得到了测序，而基于全基因组序列的比对获得某一品种/个体的特异片段，并基于此设计引物进行PCR扩增，是一种有效且准确鉴定相似品种的方法，能够简便、快速、稳定的进行菌种鉴定。

技术实现思路

[0004]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。
[0005]本专利技术的QJF
‑
2菌种，为现有技术已报道菌种，其分类命名桑树桑黄Sanghuangporus sanghuang，其藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为：CGMCC No.19653。
[0006]本专利技术采用重测序技术进行了大量的测序，并获得了目标菌株的特异片段，然后以此为基础，设计特异PCR扩增引物，其特异引物对序列为：以此为基础，设计特异PCR扩增引物，其特异引物对序列为：和使用该引物对对桑树桑黄QJF2菌株进行了PCR扩增，可以获得分子量大小为470bp的特异片段，即为桑树桑黄QJF2的分子标记。
[0007]本专利技术还公开一种桑树桑黄QJF2的分子标记的获得方法，包括如下步骤：
[0008]1)获得菌丝或者子实体；
[0009]2)基因组DNA提取；
[0010]3)基因组重测序：基因组重测序：基因组DNA被随机剪切成350bp的片段。经过末端
修复、磷酸化和添加poly
‑
A尾构建DNA文库，DNA文库在Illumina Hi Seq PE150平台进行重测序。重测序获得的原始数据使用软件fastq 0.23进行质量过滤。过滤条件为：1)删除包含接头(adapter)的reads；2)删除N含量超过5％的reads；3)删除低质量reads(Qphred≤20)的碱基数占整个reads长度的50％以上的reads；
[0011]4)将QJF2品种的高质量测序reads使用ABySS v2.0软件进行de novo拼接，获得QJF2品种的基因组草图。利用bowtie2 v2.4.4软件将过滤后的其它品种reads比对至QJF2基因组草图中，并输出BAM文件。使用bcftools v1.14软件鉴定其它品种与QJF2品种的序列变异(SNP、InDel)，获得每个品种与QJF2序列变异的的VCF文件。根据BAM文件计算每个品种序列比对至QJF2基因组草图的测序深度，根据VCF文件计算每个品种在QJF2基因组草图中的变异密度。筛选所有品种比对结果的测序深度极低或无测序reads比对，或者变异密度高于10个变异/100bp的区段，作为潜在的QJF2基因组特异性区段。对于无测序数据比对区域，判定为QJF2基因组独有片段；对于高变异区段判定为QJF2特异性强片段；
[0012]5)根据BAM文件计算每个品种序列比对至QJF2基因组草图的测序深度，根据VCF文件计算每个品种在QJF2基因组草图中的变异密度。筛选所有品种比对结果的测序深度极低或无测序reads比对，或者变异密度高于10个变异/100bp的区段，作为潜在的QJF2基因组特异性区段。对于无测序数据比对区域，判定为QJF2基因组独有片段；对于高变异区段判定为QJF2特异性强片段；
[0013]6)分子标记的PCR扩增：在筛选得到的QJF2基因组特异性区段中，设计合适的引物，用特异PCR扩增引物对桑树桑黄QJF2菌株的基因组进行PCR扩增，预期只能扩增得到QJF2基因组片段；对于强特异性片段，其它多个品种均不能扩增得到。
[0014]7)电泳检测。
[0015]所述步骤5)中PCR扩增反应体系为：总体积25μL：以桑树桑黄QJF2基因组为模板20
‑
30ng/μL 1.0μL，随机引物0.5pmol/μL各1μL，2
×
Rapid Taq Master Mix 12.5μL(购自北京Vazyme)，加水至25μL；PCR反应条件：预变性95℃ 3min：95℃ 30s 60℃ 30s，72℃ 45s 34个循环：72℃延伸5min。得到特异DNA片段大小为470bp。
[0016]本专利技术的有益效果：本专利技术公开桑树桑黄QJF2菌种的分子标记应用于桑树桑黄QJF2菌种的快速鉴定和检测。具体为采用桑树桑黄QJF2菌种菌株特异检测引物对桑树桑黄菌株进行PCR扩增，根据能否产生470bp大小的DNA片段，作为对桑树桑黄QJF2菌株进行鉴定和检测的依据。
[0017]本专利技术的检测方法与常规的形态学检测、拮抗试验和栽培出菇对比等鉴定方法相比，具有检测时间短、准确性高的优点。它既能克服形态学检测、拮抗试验精确度差，又能克服栽培出菇对比耗时长的缺点。本方法在应用于已有的桑树桑黄及杨树桑黄和粗毛纤孔菌菌株检测中发现，其具有桑树桑黄QJF2菌株的专一性。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，其中：
[0019]图1是特异引物对桑黄属菌株及粗毛纤孔菌的PCR扩增产物的电泳图谱，其中
″
1号菌株
″
为杨树桑黄
′
浙黄1号、
″
2号菌株
″
为杨树桑黄QJF3、
″
3号菌株
″
为杨树桑黄来自安徽生
产基地、
″
4号菌株
″
为粗毛纤孔菌来自陕西省微生物研究所、
″
5号菌株
″
为粗毛纤孔菌来自山东省农业科学院、
″
6号菌株
″
为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种桑树桑黄菌种的分子标记引物，其特征在于：所述桑树桑黄菌种是桑树桑黄QJF
‑
2菌种，所述分子标记引物序列为：5
′‑
ATATCAAGCGCCAGCTCGG
‑3′
和5
′‑
TGCCACGGTGCCTATAATGC
‑3′
；所述分子标记引物在所述桑树桑黄QJF
‑
2菌种中的扩增片段大小为470bp。2.权利要求1所述桑树桑黄菌种的分子标记鉴定方法，其特征在于：由以下步骤组成，(1)桑树桑黄QJF2菌种的菌株培养，获得气生菌丝；(2)提取气生菌丝中的基因组DNA；(3)基因组重测序及分析；(4)用所述分子标记引物进行PCR扩增，得到特异DNA片段大小为470bp。3.根据权利要求2所述的桑树桑黄菌种的分子标记鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，将PDA培养基灭菌后，将桑树桑黄QJF2菌种接种到PDA培养基上，避光培养，刮取气生菌丝。4.根据权利要求3所述的桑树桑黄菌种的分子标记鉴定方法，其特征在于：所述灭菌，是121℃灭菌15min；所述避光培养，是28℃避光培养14天。5.根据权利要求2～4中任一项所述的桑树桑黄菌种的分子标记鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹亚杰，胡清秀，陈晓华，徐丛涛，
申请(专利权)人：浙江千济方医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：