用于南丰蜜桔特早熟品种桂月红鉴定的InDel标记开发及应用制造技术

本发明专利技术公布了用于南丰蜜桔特早熟品种

【技术实现步骤摘要】
用于南丰蜜桔特早熟品种桂月红鉴定的InDel标记开发及应用


[0001]本专利技术属于遗传育种及分子生物学
，具体为鉴定南丰蜜桔特早熟芽变品种
‘
桂月红
’
的分子标记引物及应用。

技术介绍

[0002]南丰蜜桔是原产于我国的地方特色桔类品种，距今已有1300多年的栽培历史，因其果小皮薄、汁多无渣、味甜易剥等特点而享有“桔中之王”的美誉，南丰蜜桔同时也是江西省南丰县县域经济发展的支柱产业。然而种植规模和产量不断提升导致果实保有量激增，此外，品种结构单一，熟期集中以及苗木不纯等弊端也逐渐凸显。南丰蜜桔的价格也从早期的1.8元/斤逐年下滑至0.5～0.7元/斤，滞销现象频发。种植效益的不断降低遏制了桔农的种植积极性，管理粗放化程度加剧，造成果实品质的进一步下降，进而对南丰蜜桔品牌形象及口碑带来严重的负面影响。因此，需要选育具有与主栽品系存在明显熟期差异的南丰蜜桔新品种，拉开上市时期。目前多数柑桔新品种均来源于自然芽变，如何准确、快速地对芽变材料进行鉴定，这对于新品种保护及推广具有重要意义。传统鉴定芽变材料的方法主要通过形态学、细胞学和生化层面进行的，但存在着易受环境干扰、多态性较差以及区分度不高等弊端。鉴于市场中苗木品质良莠不齐和苗木不纯等现象频发，目前仅借助传统的鉴定技术已无法满足新品种鉴定需求，限制了产业良性发展。
[0003]分子标记技术直接以DNA序列差异为研究对象，从分子层面反映遗传物质的变化，与其它鉴定方法相比具有高效性、便捷性以及高多态性等诸多优良特性，鉴定结果稳定可靠，已逐渐成为芽变鉴定的首要手段。根据鉴定材料特性选择适宜的分子标记类型并建立对应的品种指纹图谱，可为后期品种真实性检测和苗木快速鉴定提供相应的技术支撑。分子标记技术的应用对于打击种苗假冒伪劣、保护育种人员和种植户利益、提高市场监管效率、维护产业健康发展具有重要意义。
[0004]InDel(Insertion/Deletion)标记是基于全基因组重测序的分子标记。其具有变异位点丰富，分布密度大；多态性高，具有较强的种间种内通用性；准确性高、变异稳定易于分型；检测简便，扩增产物带型清晰等优点。已在柑桔、苹果、玉米等全种类园艺作物品种鉴定上得到了广泛的应用。特早熟南丰蜜桔属于种内变异，应用形态学观察结合InDel标记可更准确地鉴定该芽变材料，提升南丰蜜桔新品种选育效率。
[0005]南丰蜜桔品种
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桂月红
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是于江西省南丰县下甘村发现的南丰蜜桔特早熟芽变单株，其成熟期为9月下旬，相较于11月中旬成熟的普通南丰蜜桔品系提前了近60天。完熟的
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桂月红
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果实为扁圆形，单果重量22.72g，无籽；果皮果肉均为金黄色，外观品质优良；可溶性固形物15.63％，可滴定酸0.49％，VC含量为22.44mg/100g，糖酸方面均显著优于同一时期的普通南丰蜜桔品系；年平均单株产量57.93kg，丰产稳产性良好，大小年现象不明显。
[0006]本专利技术旨在开发针对于
‘
桂月红
’
特早熟南丰蜜桔的特异性分子标记，有利于从分子水平上将该品种与目前主栽的南丰蜜桔品系进行区分界定，同时可为品种保护与快速鉴
定提供技术支持。

技术实现思路

[0007]本专利技术通过对20个南丰蜜桔品种/品系材料进行全基因组重测序和分析筛选，获得2个核心InDel标记并进行引物设计，利用设计的两对InDel引物对，可对南丰蜜桔
‘
桂月红
’
品种实现特异性扩增，还可广泛应用于南丰蜜桔的遗传多样性分析。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：
[0009]用于南丰蜜桔
‘
桂月红
’
品种鉴定的分子标记引物的获得：对本专利技术的20个南丰蜜桔品种/品系材料进行全基因组重测序后利用bwa软件将过滤并获得的clean reads与甜橙参考基因组(http://citrus.hzau.edu.cn/download.php)进行比对。进一步对比分析
‘
桂月红
’
品种与其他19个南丰蜜桔品种/品系间的差异InDel位点，从而筛选出两者间的特异InDel位点。再根据结果选取插入/缺失片段大于3bp的InDel位点，同时剔除上下游50bp存在另外插入/缺失片段的InDel位点，最终获得差异InDel位点库。随后再基于甜橙全基因组序列，将筛选出的InDel位点定位在基因组上，取InDel位点两翼各300bp碱基长度，共600bp片段长度进行引物设计。利用设计合成的引物对南丰蜜桔
‘
桂月红
’
品种进行PCR扩增，筛选得到两对InDel引物：TZS
‑
InDel
‑
16和TZS
‑
InDel
‑
56，针对其设计的引物为TZS
‑
InDel
‑
16
‑
F：GCATGACCAACATATGCTTG(SEQ ID NO.1)、TZS
‑
InDel
‑
16
‑
R：AGACACATCATCGGTTGCAG(SEQ ID NO.2)和TZS
‑
InDel
‑
56
‑
F：TCCACTTCGAAGGCCACACTTTCTG(SEQ ID NO.3)、TZS
‑
InDel
‑
56
‑
R：ATGGAGGGATAGAGGAGGGT(SEQ ID NO.4)。
[0010]上述引物对在南丰蜜桔特早熟桂月红品种育种或品种鉴定中的应用：利用上述引物对在桂月红品种中扩增出189bp和259bp两条条带。
[0011]上述引物对在南丰蜜桔品种鉴定中的应用，所述的南丰蜜桔品种包括桂橘一号、南丰2号、杨小2
‑
6、火桔、97
‑
2小果和大叶红桔，具体地，桂橘一号扩增出185bp、195bp、259bp三条条带，南丰2号扩增出184bp、190bp、256bp、271bp四条条带，杨小2
‑
6扩增出189bp、238bp、259bp、268bp四条条带，火桔扩增出182bp、190bp、238bp、259bp、269bp五条条带，97
‑
2小果扩增出181bp、189bp、185bp、269bp四条条带，大叶红桔扩增出180bp、240bp、272bp三条条带。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的优点：
[0013]1.分子标记技术操作便捷，不受组织类别、发育阶段、环境条件的影响，是DNA水平遗传多态性的直接反映。其中InDel标记具有遗传稳定性高、分布广泛、多态性高和适用于亲缘关系较近的品种间研究等优点。
[0014]2.本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于南丰蜜桔特早熟桂月红品种鉴定的分子标记引物对，其特征在于，所述的引物对TZS
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InDel
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16的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，引物对TZS
‑
InDel
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56的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示。2.权利要求1 所述的引物对在南丰蜜桔特早熟桂月红品种育种中的应用。3.权利要求1 所述的引物对在南丰蜜桔特早熟桂月红品种鉴定中的应用。4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，利用权利要求1所述的引物对在桂月红品种中扩增出189 bp和259 bp两条条带。5.权利要求1所述的引物对在南丰蜜桔品种的遗传多样性分析中的应用。6.权利要求1所述的引物对在鉴定南丰蜜...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊华林，吴巨勋，李锡媛，徐宸宇，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：