NK细胞的大规模组合CAR转导和CRISPR基因编辑制造技术

本公开内容的实施方案包括用于生产工程化天然杀伤(NK)细胞的方法和组合物。本公开内容涉及用于生产NK细胞的大规模工艺，所述NK细胞经工程化以破坏一种或多种基因的表达，例如使用CRISPR，并且还经工程化以表达至少一种异源抗原受体。具体实施方案包括用于该工艺的特定参数。定参数。定参数。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】NK细胞的大规模组合CAR转导和CRISPR基因编辑
[0001]本申请要求2019年11月27日提交的美国临时专利申请序列号62/941,134的优先权，该专利申请通过引用整体并入本文。
[0002]序列表
[0003]本申请包含以ASCII格式电子提交并在此通过引用整体并入本文的序列表。于2020年11月12日创建的所述ASCII副本命名为UTSC_P1199WO_SL.txt，大小为5,505字节。


[0004]本公开内容一般至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。
[0005]背景
[0006]细胞免疫治疗对癌症的治疗前景广阔。然而，大多数免疫治疗方法单独应用时对大多数恶性肿瘤(包括实体瘤)的价值有限。这种有限成功的原因包括(1)肿瘤细胞表面上肿瘤抗原的减少的表达，其降低了免疫系统对其的检测；(2)抑制性受体的配体(例如PD1、NKG2A、TIGIT)的表达；(3)细胞检查点的上调，例如诱导免疫细胞失活的CISH；和(4)在微环境中诱导细胞(例如调节性T细胞或髓系来源的抑制细胞)，其释放抑制免疫应答并促本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产工程化NK细胞的体外方法，包括以下步骤：(a)用抗原呈递细胞和有效量的白细胞介素(IL)
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2将NK细胞扩增第一时间段以产生扩增的NK细胞；(b1)和(c1)或(b2)和(c2)中的一个：(b1)用各自编码一种或多种异源抗原受体的一种或多种载体转导或转染(a)的扩增的NK细胞，以产生修饰的NK细胞；(c1)在第二时间段之后，将有效量的Cas9和一种或多种引导RNA递送至修饰的NK细胞以破坏NK细胞中一种或多种基因的表达，从而产生基因编辑的修饰的NK细胞；或(b2)将有效量的Cas9和一种或多种引导RNA递送至(a)的扩增的NK细胞以破坏NK细胞中一种或多种基因的表达，从而产生基因编辑的NK细胞；(c2)在第二时间段之后，用各自编码一种或多种异源抗原受体的一种或多种载体转导或转染基因编辑的NK细胞，以产生基因编辑的修饰的NK细胞；和(d)在存在有效量的抗原呈递细胞和有效量的IL
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2的情况下，将(c1)或(c2)的基因编辑的修饰的NK细胞扩增第三时间段。2.权利要求1的方法，其中所述基因编辑的修饰的NK细胞由(b1)和(c1)的步骤产生。3.权利要求1的方法，其中所述基因编辑的修饰的NK细胞由(b2)和(c2)的步骤产生。4.权利要求1的方法，其中(c1)和(b2)的步骤各自进一步定义为两个或更多个递送步骤。5.权利要求4的方法，其中第一递送步骤包括递送靶向一种或多种基因的引导RNA，并且第二递送步骤包括递送靶向与所述第一递送步骤中的一种或多种基因不同的一种或多种基因的引导RNA。6.权利要求5的方法，其中所述第一递送步骤和所述第二递送步骤之间的持续时间为至少约两天。7.权利要求5的方法，其中所述第一递送步骤和所述第二递送步骤之间的持续时间为约2至3天。8.权利要求1
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7中任一项的方法，其中所述第一时间段为约5
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7天。9.权利要求1
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8中任一项的方法，其中所述第二时间段为约2天。10.权利要求1
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9中任一项的方法，其中所述第三时间段为至少约7天。11.权利要求1
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10中任一项的方法，其中所述第三时间段为约1
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2周。12.权利要求1
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11中任一项的方法，其中递送步骤是通过电穿孔进行的。13.权利要求12的方法，其中电穿孔使用约200,000个细胞至1x109个NK细胞。14.权利要求12的方法，其中电穿孔使用约200,000至2,000,000个细胞。15.权利要求12的方法，其中电穿孔使用约1,000,000至1x109个NK细胞。16.权利要求1
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15中任一项的方法，还包括在(a)之前耗竭CD3阳性、CD14阳性和/或CD19阳性细胞的NK细胞的步骤。17.权利要求1
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16中任一项的方法，其中在(a)和/或(d)中，NK细胞与抗原呈递细胞的比率为1:1、1:1.5、1:2或1:3。18.权利要求12的方法，其中所述电穿孔步骤中所述引导RNA的浓度为3、4或5μM。
19.权利要求12的方法，其中所述电穿孔步骤中Cas9核酸酶的浓度为4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5μM。20.权利要求1
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19中任一项的方法，其中IL
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2的浓度为约100单位/ml至约300单位/ml。21.权利要求20的方法，其中IL
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2的浓度为100、125、150、175、200、225、250、275或300单位/ml。22.权利要求1
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21中任一项的方法，还包括在步骤(b1)或(b2)之前耗竭CD3阳性、CD14阳性和/或CD19阳性细胞的NK细胞的步骤。23.权利要求1
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22中任一项的方法，其中(a)中的NK细胞衍生自脐带血、外周血、骨髓、干细胞、细胞系或其混合物。24.权利要求1
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23中任一项的方法，其中所述异源抗原受体是嵌合抗原受体或T细胞受体。25.权利要求1
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24中任一项的方法，其中所述异源抗原受体靶向肿瘤相关抗原。26.权利要求1
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24中任一项的方法，其中所述异源抗原受体靶向选自以下的抗原：CD19、EBNA、CD123、HER2、CA
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125、TRAIL/DR4、CD20、CD70、HLA
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G、CD38、CD123、CLL1、癌胚抗原、甲胎蛋白、CD56、AKT、Her3、上皮肿瘤抗原、CD319(CS1)、ROR1、叶酸结合蛋白、HIV
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1包膜糖蛋白gp120、HIV
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1包膜糖蛋白gp41、CD5、CD23、CD30、HERV
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K、IL
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11Rα、κ链、λ链、CSPG4、CD33、CD47、CLL
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1、U5snRNP200、CD200、BAFF
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R、BCMA、CD99、p53、突变的p53、Ras、突变的ras、c
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Myc、胞浆丝氨酸/苏氨酸激酶、MAGE
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A1、MAGE
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A2、MAGE
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A3、MAGE
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A4、MAGE
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A6、MAGE
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A10、MAGE
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A12、MART
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1、黑色素瘤相关抗原、BAGE、DAM
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6、
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10、GAGE
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1、GAGE
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2、GAGE
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3、GAGE
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4、GAGE
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5、GAGE
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6、GAGE
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7A、GAGE
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7B、GAGE
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8、NA88
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A、MC1R、MDA
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7、gp75、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白、TRP
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1、TRP
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2、ART
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4、CAMEL、CEA、Cyp
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【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：得克萨斯大学体系董事会，
类型：发明
国别省市：