用于多功能和有效的基因表达的RNA复制子制造技术

本申请涉及用于多功能和有效的基因表达的RNA复制子。本发明专利技术包括可以通过甲病毒来源的复制酶复制的RNA复制子。所述RNA复制子包含复制酶进行复制所需的序列元件，但这些序列元件不编码任何蛋白质或其片段。在根据本发明专利技术的RNA复制子中，通过复制酶进行复制所需的序列元件和蛋白质编码区是解偶联的。根据本发明专利技术，通过与天然甲病毒基因组RNA相比移除至少一个起始密码子实现解偶联。特别地，RNA复制子包含5

【技术实现步骤摘要】
用于多功能和有效的基因表达的RNA复制子
[0001]本申请是申请号为201780019155.1的专利技术名称为“用于多功能和有效的基因表达的RNA复制子”的中国专利申请的分案申请，原申请是2017年03月13日提交的PCT国际申请PCT/EP2017/055808于2018年09月21日进入中国国家阶段的申请。


[0002]本专利技术包括可以通过甲病毒来源的复制酶复制的RNA复制子。RNA复制子包含通过复制酶进行复制所需的序列元件，但这些序列元件不编码任何蛋白质或其片段，例如甲病毒非结构蛋白或其片段。因此，在根据本专利技术的RNA复制子中，通过复制酶进行复制所需的序列元件和蛋白质编码区是解偶联的。根据本专利技术，通过与天然甲病毒基因组RNA相比移除至少一个起始密码子实现解偶联。RNA复制子可包含编码目的蛋白(例如药学活性蛋白)的基因。复制酶可以由RNA复制子或单独的核酸分子编码。

技术介绍

[0003]多年来在生物医学研究中已经研究了用于预防和治疗目的的包含编码一种或更多种多肽之外来遗传信息的核酸分子。现有技术方法将核酸分子向靶细胞或生物体的递送相同，但核酸分子和/或递送系统的类型不同：受与使用脱氧核糖核酸(DNA)分子相关的安全性问题的影响，近年来，核糖核酸(RNA)分子受到越来越多的关注。已经提出了多种方法，包括以裸RNA形式，或者以复合或包装形式(例如，在非病毒或病毒递送载体中)施用单链或双链RNA。在病毒和病毒递送载体中，遗传信息通常由蛋白质和/或脂质(病毒颗粒)包封。例如，已提出来源于RNA病毒的经改造的RNA病毒颗粒作为用于处理植物(WO 2000/053780 A2)或用于哺乳动物疫苗接种(Tubulekas等,1997,Gene,第190卷,第191
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195页)的递送载体。通常，RNA病毒是具有RNA基因组的一组多样感染性颗粒。RNA病毒可以分组为单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)病毒，并且ssRNA病毒通常可以进一步分为正链[(+)链]和/或负链[(
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)链]病毒。正链RNA病毒作为生物医学中的递送系统初步看来是有吸引力的，因为它们的RNA在宿主细胞中可以直接用作用于翻译的模板。
[0004]甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒的宿主包括多种生物，包括昆虫、鱼和哺乳动物，例如家养动物和人。甲病毒在感染细胞的细胞质中复制(关于甲病毒生命周期的综述，参见Jos
é
等,Future Microbiol.,2009,第4卷,第837
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856页)。许多甲病毒的总基因组长度通常为11,000至12,000个核苷酸，并且基因组RNA通常具有5
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帽和3
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poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(ORF)。四种非结构蛋白(nsP1
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nsP4)通常由在基因组5
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末端附近开始的第一个ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由在第一个ORF的下游发现的并延伸靠近基因组的3
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末端的第二个ORF一起编码。通常，第一个ORF多于第二个ORF，比例大致为2:1。
[0005]在由甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，所述亚基因组转录物是类似于真核信使
RNA的RNA分子(mRNA；Gould等,2010,Antiviral Res.,第87卷,第111
–
124页)。感染后，即在病毒生命周期的早期阶段，(+)链基因组RNA像信使RNA一样直接用于翻译编码非结构多聚蛋白(nsP1234)的开放阅读框。在一些甲病毒中，在nsP3和nsP4的编码序列之间存在乳白终止密码子(opal stop codon)：当翻译在乳白终止密码子处终止时产生含有nsP1、nsP2和nsP3的多聚蛋白P123以及通过通读该乳白密码子产生的另外含有nsP4的多聚蛋白P1234(Strauss&Strauss,Microbiol.Rev.,1994,第58卷,第491
‑
562页；Rupp等,2015,J.Gen.Virology,第96卷,第2483
‑
2500页)。nsP1234被自我蛋白水解切割成片段nsP123和nsP4。多肽nsP123和nsP4缔合形成(
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)链复制酶复合物，其使用(+)链基因组RNA作为模板转录(
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)链RNA。通常在后期阶段，nsP123片段被完全切割成单个蛋白质nsP1、nsP2和nsP3(Shirako&Strauss,1994,J.Virol.,第68卷,第1874
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1885页)。所有四种蛋白质形成(+)链复制酶复合物，其使用基因组RNA的(
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)链互补序列作为模板合成新的(+)链基因组(Kim等,2004,Virology,第323卷,第153
‑
163页,Vasiljeva等,2003,J.Biol.Chem.第278卷,第41636
‑
41645页)。
[0006]在感染的细胞中，亚基因组RNA以及新的基因组RNA由nsP1提供5
’‑
帽(Pettersson等，1980,Eur.J.Biochem.105,435
‑
443；Rozanov等,1992,J.Gen.Virology,第73卷,第2129
‑
2134页)，并由nsP4提供多腺苷酸[poly(A)]尾(Rubach等,Virology,2009,第384卷,第201
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208页)。因此，亚基因组RNA和基因组RNA二者都类似于信使RNA(mRNA)。
[0007]甲病毒结构蛋白(核心核衣壳蛋白C、包膜蛋白E2和包膜蛋白E1，病毒颗粒的所有成分)通常由亚基因组启动子控制下的单个开放阅读框编码(Strauss&Strauss,Microbiol.Rev.,1994,第58卷,第491
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562页)。亚基因组启动子被顺式作用的甲病毒非结构蛋白所识别。特别地，甲病毒复制酶使用基因组RNA的(
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)链互补序列作为模板合成(+)链亚基因组转录物。(+)链亚基因组转录物编码甲病毒结构蛋白(Kim等,2004,Virology,第323卷,第153
‑
163页,Vasiljeva等,2003,J.Biol.Chem.第278卷,第41636
‑
41645页)。亚基因组RNA转录物用作将编码结构蛋白的开放阅读框翻译为一种多聚蛋白的模板，并且多聚蛋白被切割以产生结构蛋白。在宿主细胞中甲病毒感染的晚期，位于nsP2编码序列内的包装信号确保将基因组R本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.RNA复制子，其包含5
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复制识别序列，其中所述5
’
复制识别序列的特征在于其包含与天然甲病毒5
’
复制识别序列相比至少一个起始密码子的移除。2.根据权利要求1所述的RNA复制子，其中所述5
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复制识别序列包含与甲病毒5
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末端处约250个核苷酸同源的序列，并且优选包含与甲病毒5
’
末端处约300至约500个核苷酸同源的序列。3.根据权利要求1或2所述的RNA复制子，其中所述5
’
复制识别序列包含与甲病毒的保守序列元件1和保守序列元件2同源的序列。4.根据权利要求3所述的RNA复制子，其中保守序列元件2包含来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框的片段。5.根据权利要求1至4中任一项所述的RNA复制子，其中所述5
’
复制识别序列包含与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列，其中所述与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于其包含与天然甲病毒序列相比至少一个起始密码子的移除。6.根据权利要求5所述的RNA复制子，其中所述与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于其包含非结构蛋白的开放阅读框的至少天然起始密码子的移除。7.根据权利要求5或6所述的RNA复制子，其中所述与来自甲病毒的非结构蛋白的开放阅读框或其片段同源的序列的特征在于其包含非结构蛋白的开放阅读框的天然起始密码子之外的一个或更多个起始密码子的移除。8.根据权利要求1至7中任一项所述的RNA复制子，其包含一个或更多个核苷酸变化，所述核苷酸变化补偿通过移除至少一个起始密码子而引入的一个或更多个茎环内的核苷酸配对破坏。9.根据权利要求1至8中任一项所述的RNA复制子，其不包含编码截短的甲病毒非结构蛋白的开放阅读框。10.根据权利要求1至9中任一项所述的RNA复制子，其包含3
’
复制识别序列。11.根据权利要求1至10中任一项所述的RNA复制子，其包含编码目的蛋白的第一开放阅读框。12.根据权利要求11所述的RNA复制子，其中由所述第一开放阅读框编码的所述目的蛋白能够由所述RNA复制子作为模板来表达。13.根据权利要求11或12所述的RNA复制子，其包含控制亚基因组RNA产生的亚基因组启动子，所述亚基因组RNA包含编码目的蛋白的所述第一开放阅读框。14.根据权利要求13所述的RNA复制子，其中由所述第一开放阅读框编码的所述目的蛋白能够由所述RNA复制子和亚基因组RNA表达。15.根据权利要求11或12所述的RNA复制子，其包含控制亚基因组RNA产生的亚基因组启动子，所述亚基因组RNA包含编码目的蛋白的第二开放阅读框。16.根据权利要求15所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂姆，
申请(专利权)人：约翰，
类型：发明
国别省市：