检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法及其应用技术

本发明专利技术检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法及其应用，属于生物医学技术领域。该方法包括：以人CMKLR1、GPR1基因为检测的目标基因，人GAPDH、ACTB基因为检测的内参基因，分别设计上下游引物和探针；在同一个反应体系中，加入RT

【技术实现步骤摘要】
检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法及其应用。

技术介绍

[0002]G蛋白偶联受体超家族(GPCRs)在胞外信号向胞内转导过程中起到重要的作用，调控着细胞运动、生长和基因转录这三个癌症生物学中至关重要的因素。过去的十几年中，介导的信号通路已经被证明是原癌基因信号的关键调控者，并且是很好的病症诊断靶点。
[0003]Chemerin，又被称为维甲酸受体反应物2(retinoic acid receptor responderprotein 2)，是一种脂肪因子。Chemerin的主要来源之一是内脏脂肪组织，可调节脂肪细胞的分化和代谢功能，并且它的在循环血中的水平与BMI、肥胖进展和胰岛素抵抗有严密的关联(Robker,Wu,and Yang 2011)。Chemerin通过受体结合发挥其生物学效应，三种受体，截止目前为止：趋化因子样受体1(CMKLR1或ChemR23)、G蛋白偶联受体1(GPR1)和趋化因子(C
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C基序)受体样受体2(CCRL2)，可以与chemerin结合发挥生物学功效。De Henau等揭示出chemerin与CMKLR1和GPR1具有相似的亲和力，但与CCRL2的亲和力较低。本申请人研究表明GPR1和CMKLR1激活的通路似乎是chemerin的生物学行为的主要原因，二者都激活ERK1/2
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MAPK通路。Chemerin/CMKLR1对代谢相关的功能具有调控作用。在脂肪前体细胞3T3
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L1中，shRNA抑制chemerin和受体CMKLR1的表达，能够显著抑制前体细胞分化为成熟的脂肪细胞的效率，同时抑制脂肪分化相关基因的表达。在CMKLR1敲除小鼠的研究中，小鼠表现出糖代谢紊乱和胰岛素分泌增加的现象。在chemerin敲除小鼠中，敲除chemerin后增加胰岛素的分泌，并导致胰岛素抵抗的发生。从这些研究中可以得出结论：chemerin/CMKLR1信号系统调控体内胰岛素分泌和葡萄糖代谢。在生殖内分泌中，chemerin对雌激素和雄激素都具有重要的调节功能。卵巢染色结果表明，CMKLR1在卵巢的膜细胞中表达，而GPR1在卵巢的颗粒细胞和黄体颗粒细胞中表达。在睾丸的研究中，chemerin的受体CMKLR1和GPR1特异性表达在人和小鼠睾丸间质细胞中表达，chemerin抑制HCG引起的睾酮分泌，同时抑制激素合成酶3β
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HSD基因和蛋白表达水平。Chemerin多囊卵巢的病人血清中高表达，经过Metformin的治疗后，这些病人血清中chemerin含量显著降低，表明chemerin/CMKLR1信号通路在多囊卵巢综合征的发生过程中的重要作用。在高雄激素诱导的多囊卵巢综合征小鼠模型中，受体CMKLR1的缺失能够有效地改善卵巢多囊症状，降低雄激素的水平。组织分布上，GPR1与CMKLR1在哺乳动物组织细胞分布相似，主要表达于白色脂肪组织和肺脏，在心、肝、肾、脾脏、胸腺、骨骼肌、脑、棕色脂肪也有表达，但GPR1在骨骼肌、脑和棕色脂肪中高表达，而CMKLR1表达较低。GPR1在脂肪组织的基质血管组分中的表达较脂肪组织更高。GPR1在内皮细胞、淋巴细胞和白细胞中未见表达。GPR1与CMKLR1在chemerin信号系统内各种具有类似的功能，但又有所区别，在这一体系中检测各自的表达情况对后续研究具有重要意义。因此，以CMKLR1及GPR1为检测点，建立相关的检测方法，为与CMKLR1及GPR1表达量变化相关
病症的临床诊断提供依据。
[0004]CMKLR1基因表达检测的常用方法主要包括原位杂交、Northern、RT
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PCR、qRT
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PCR等方法。其中，原位杂交法结果较为直观，并能实现肿瘤组织中待检标志物的定位检测，但存在着操作繁琐、耗时，试剂成本高，且检测判读存在较大的主观性，易造成假阳性结果等缺点，不适应“快速、简便”的检测需要。Northern blotting是经典的检测基因表达的方法，承认率高，但是操作复杂，实验中涉及到放射性同位素。而常规RT
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PCR法需要通过凝胶电泳检测产物，因此在操作过程中易造成二次污染，并且无法对起始模板量进行准确的计算。
[0005]目前尚未见到可实现在一个反应管同时检测CMKLR1、GPR1基因和双内参基因表达的qRT
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PCR方法的报道。为了缩短检测时间、减少操作而引起污染的几率，利用一步法RT
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PCR实现逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一个反应管中顺次进行。与传统的利用RNA逆转录后的cDNA为模板相比，一步法具有快速、简便、敏感、减少污染机会，减少了mRNA二级结构的特点。同时，为了提高检测结果的可靠性，在检测反应中引入双内参。应用RT
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qPCR进行基因表达分析，需要表达稳定的内参基因对实验数据标准化。但有研究发现没有内参基因在所有实验条件下均可以“通用”，且使用单独内参基因会出现相对误差。采用不同单内参基因，其差异可从3倍到6.4倍，个别样本的表达差异甚至高达20倍，而采用多内参基因与单内参基因的结果可能相反或错误。因此，为了提高CMKLR1检测结果的可靠性，本方法以双内参基因进行校正。

技术实现思路

[0006]针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法及其应用，本专利技术检测方法具有样本量小、操作简单、检测用时短、可靠性高的优点，可用于人CMKLR1、GPR1基因表达快速检测。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供以下的技术方案：
[0008]一方面，本专利技术提供了一种检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法，包括以下步骤：
[0009](1)以人CMKLR1基因为检测的目标基因，针对CMKLR1基因部分片段设计上游引物CMKLR1
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F、下游引物CMKLR1
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R和探针CMKLR1
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P；
[0010](2)以人GPR1基因为检测的目标基因，针对GPR1基因部分片段设计上游引物GPR1
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F、下游引物GPR1
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R和探针GPR1
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P；
[0011](3)以人GAPDH基因为检测的内参基因，针对GAPDH基因部分片段设计上游引物GAPDH
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F、下游引物GAPDH
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R和探针GAPDH
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P；
[0012](4)以人ACTB基因为检测的第二个内参基因，针对ACTB基因部分片段设计上游引物ACTB
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F、下游引物ACTB
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R和探针ACTB
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法，其特征在于包括以下步骤：(1)以人CMKLR1基因为检测的目标基因，针对CMKLR1基因部分片段设计上游引物CMKLR1
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F、下游引物CMKLR1
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R和探针CMKLR1
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P；(2)以人GPR1基因为检测的目标基因，针对GPR1基因部分片段设计上游引物GPR1
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F、下游引物GPR1
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R和探针GPR1
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P；(3)以人GAPDH基因为检测的内参基因，针对GAPDH基因部分片段设计上游引物GAPDH
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F、下游引物GAPDH
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R和探针GAPDH
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P；(4)以人ACTB基因为检测的第二个内参基因，针对ACTB基因部分片段设计上游引物ACTB
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F、下游引物ACTB
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R和探针ACTB
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P；(5)在同一个反应体系中，将RT
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PCR缓冲液、反转录酶、Taq酶、待测样本总RNA、上述步骤(1)得到的上游引物CMKLR1
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F、下游引物CMKLR1
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R、探针CMKLR1
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P，上述步骤(2)得到的上游引物GPR1
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F、下游引物GPR1
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R、探针GPR1
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P，上述步骤(3)得到的上游引物GAPDH
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F、下游引物GAPDH
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R、探针GAPDH
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P，上述步骤(4)得到的上游引物ACTB
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F、下游引物ACTB
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R、探针ACTB
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P混合，获得反应体系；(6)利用上述步骤(5)获得的反应体系进行反转录及实时荧光定量PCR反应，同时进行荧光信号采集；(7)根据上述步骤(6)实时荧光定量PCR反应的结果，若GAPDH和ACTB内参基因对应的Ct值在10
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25范围内，且靶基因CMKLR1、GPR1对应的Ct值≤35，同时无模板对照组Ct值无度数或Ct≥40，则判定CMKLR1、GPR1基因在待测样本中表达，并计算人CMKLR1基因表达量的计算公式如下式1，GPR1基因表达量的计算公式如下式2；公式如下式1，GPR1基因表达量的计算公式如下式2；2.如权利要求1所述的检测人CMKLR1、GPR1基因表达量的多重荧光探针定量方法，其特征在于所述上游引物CMKLR1
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物CMKLR1
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针CMKLR1
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P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，上游引物GPR1
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物GPR1
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针GPR1
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P的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，上游引物GAPDH
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物GAPDH
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针GAPDH
‑
P的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，上游...

【专利技术属性】
技术研发人员：张键，智达夫，陈杰，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：