一种高通量神经环路解析方法和系统技术方案

本发明专利技术公开了一种高通量神经环路解析方法和系统。神经环路解析方法包括样品制备、超快光清除、高速高分辨脑组织成像、高通量三维图像拼接和自动神经细胞重构。样品制备包括固定、切片、染色等步骤；超快光清除方法只需使用超快光清除试剂孵育脑片3min左右即可；Schwartz调制的晶格光片显微成像具有成像速度快，分辨率高等优势；高通量图像拼接方法能够将荧光显微成像系统得到的光强信号拼接成全脑的三维成像结果；自动神经细胞重构方法能够从全脑的三维成像结果中，自动重构神经元、星形胶质细胞、血管等组织的结构。高通量神经环路解析系统能够在数小时内实现全脑的三维成像和神经环路解析，具有极高的应用和研究价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量神经环路解析方法和系统


[0001]本专利技术属于荧光显微成像与重构
，具体涉及一种高通量神经环路解析方法和系统。

技术介绍

[0002]脑功能的研究对情感、记忆、意识等的脑结构基础和产生机理，神经系统疾病的诊断和治疗，人类生活质量的提高以及脑机系统的开发等都至关重要。神经环路是脑功能的基本单位，负责信息采集、处理、传输等工作，可以说生物体几乎所有的活动都是受神经环路的控制。神经环路解析的基础是脑组织的高分辨率快速三维成像，然而脑组织具有高散射性和高浑浊度，这极大地限制了光学成像系统的成像深度。
[0003]光清除技术通过脱色、脱钙和折射率匹配减少散射和折射，提高激发光和发射光的组织穿透能力，从而显著提高光学显微镜的成像深度。然而，现有的光清除技术存在光清除速度与荧光保留能力不兼备的缺陷。光清除技术与光学显微成像技术的结合，使脑片甚至全脑的三维荧光成像成为可能。
[0004]光学显微成像技术中，光片荧光显微镜（LSFM）的激发和发射光路相互垂直，采用线扫描或面扫描替代点扫描，显著提高了成像速度，降低了光漂白和光毒性。然而即使是经过光清除的生物组织也并不是完全透明的，LSFM在进行生物组织内部毫米甚至厘米级的深度成像时也存在着组织吸收和散射导致的光针变形、旁瓣干扰大、数据处理困难等问题。
[0005]在实现了脑组织的高分辨率快速三维成像之后，还需要对成像结果进行三维图像拼接和神经细胞重构等图像处理操作，以实现神经环路的高通量解析。

技术实现思路

[0006]为了解决
技术介绍
中的问题，本专利技术提出一种脑片超快光清除方法，并与Schwartz调制的晶格光片显微成像技术相结合，实现脑组织的超快高分辨三维成像，进而提出一种高通量图像拼接与神经细胞重构方法，实现高通量神经环路解析；此外，还提出一种光清除评估方法，实现光清除效果的精准量化评估。
[0007]本专利技术采用的技术方案如下：一、一种高通量神经环路解析方法，具体步骤如下：1）对已脱离人体或动物体的脑组织进行固定、切片后获得脑片；2）对无荧光的脑片进行染色，已表达免疫荧光蛋白的转基因动物（如Thy1
‑
eGFP
‑
M标记的小鼠）无需染色；3）对所有脑片进行超快光清除，然后进行光清除效果的量化评估，并对评估结果进行判断：若光清除效果T达到85%，执行下一步骤3）；若光清除效果T未达到85%，重复当前超快光清除的操作；4）利用高速LSFM系统对光清除后的脑片进行超快高分辨成像；5）将所有脑片的成像结果进行高通量的三维图像拼接和自动神经细胞重构，从而
完成高通量神经环路解析。
[0008]所述步骤2）中：染色采用免疫荧光染色、免疫组织化学染色、化学染料染色和病毒感染表达荧光蛋白的方法。免疫荧光染色法具体是：组织样本加入一抗孵育使抗体完全结合靶位点，再使用PBST洗脱多余的一抗，然后加入携带有荧光基团的二抗进行孵育，使二抗与一抗结合，最后用PBST洗脱多余的二抗。
[0009]对于自表达荧光蛋白的生物组织，不需要生物组织染色步骤，而是直接进行成像。
[0010]所述步骤3）中的超快光清除试剂是尿素溶于二甲基亚砜（DMSO）溶剂中形成的混合试剂。尿素溶于DMSO的质量体积比是25％
‑
35％。
[0011]所述的尿素为市售产品，是主要的光清除成分，用于非破坏性的溶解细胞膜，具备快速和强大的脱水作用。还能使蛋白质溶解、变性，增进水合作用，进而提高光清除效果。
[0012]所述的DMSO为市售产品，是一种亲水性有机溶剂，不仅可以起到折射率匹配的作用，还能够在膜上诱导出瞬时水孔道，增加生物膜通透性。
[0013]超快光清除方法只需将超快光清除试剂滴加到脑片上，孵育3min左右即可，有着操作简单、处理时间快、光清除效果好和荧光保留能力好等优点。
[0014]所述步骤3）中，光清除效果的量化评估方法的具体步骤如下：3.1）将脑片置于透明培养皿中，培养皿置于黑色的拍摄背景上，采用白光照明，利用相机拍摄得到光清除前的脑片图像和光清除后的脑片图像；借助黑色边框和白色填充对拍摄到的图片进行亮度归一化；拍摄背景中心为黑色实心方框，中心黑框周边均是边框为黑色填充为白色的方格，培养皿放置于中心黑框上；3.2）对图像的中心黑框进行自动识别，找到中心黑框所在区域进行裁剪，得到裁剪后的图像b；3.3）对裁剪后的图像进行图像增强处理，提高图像对比度，然后进行二值化；3.4）对二值化后的图像去孤点，得到图像e，图像e中的白色区域为第一次预识别的脑片区域；去孤点时可以将黑色区域的阈值设置的较大，用于去除噪点，白色区域的阈值设置的较小，避免脑室被误认为是有脑组织的区域；但因为脑片所在区域的光强均值与脑片外的光强均值没有明显的差异，所以第一次预识别的脑片区域坐标往往是不准确的；3.5）采用预识别的脑片和背景范围的坐标的强度均值对第3.2步的图像b进行处理，增大脑片范围内和范围外的强度差异；将图像b中与图像e中白色区域对应的区域的坐标的数值增大至两倍以上；将图像b中与图像e中黑色区域对应的区域的坐标的数值减小至二分之一以下；3.6）进行降噪和二值化处理；3.7）再去孤点即可得到脑片所在的区域，白色区域为脑区，黑色区域为非脑区，白色像素点总和即为脑片面积。
[0015]将识别出的脑区所有像素点的亮度均值定义为I，非脑区（背景）所有像素点的亮度均值定义为I
b
，光清除效果T的定义为：
[0016]其中，I
o
、I
ob
分别为光清除前的脑区与非脑区所有像素点的亮度均值。
[0017]利用该光清除量化评估方法，可以对脑片的光清除效果进行精准、高效的量化评价，并将脑片面积的计算精确到像素级。
[0018]所述步骤4）中，超快高分辨三维成像的方法为：4.1）将样品置于透明容器中，其中填充光清除试剂，置于成像系统的物镜焦点处；4.2）打开激光、高速空间光调制器（SLM）或数字微镜阵列（DMD）、共振振镜电源；4.3）光经过光束校正后入射到DMD/SLM中生成晶格层光，并对晶格层光进行Schwartz调制，调制函数为：
[0019]其中：
[0020]其中，t表示光斑半径的平方，θ表示调制片的角度，x表示沿调制片径向方向的坐标，表示调制片内侧收敛系数，表示调制片外侧收敛系数，表示收敛函数，表示收敛系数，收敛系数代表了或者，exp表示常数e；4.4）Schwartz调制的晶格层光依次经过两个振镜、扫描透镜、套筒透镜实现物光的二维扫描；4.5）晶格层光最后经过第一个物镜生成光针，步骤4.4）中第二个振镜的作用为将光针变成光片，第一个振镜的作用为实现光片在成像深度方向的扫描；4.6）光针通过脑组织样品后使免疫荧光蛋白发出荧光，荧光经过第二个成像物镜收集，由sCMOS进行成像。
[0021]相比于传统的LSFM，高速LSFM系统利用SLM或DMD对光源进行调制，实现Schwartz调制的晶格层光入射，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量神经环路解析方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将离体的脑组织进行切片，并对获取的脑片进行染色；2）对所有脑片进行超快光清除，然后进行光清除效果的量化评估，并对评估结果进行判断：若光清除效果T达到85%，执行下一步骤3）；若光清除效果T未达到85%，重复当前超快光清除的操作；3）利用高速LSFM系统对光清除后的所有脑片进行高速高分辨三维成像；4）将所有脑片的成像结果进行高通量的三维图像拼接和自动神经细胞重构的图像处理操作，从而完成高通量神经环路解析。2.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤1）中：对已脱离人体或动物体的脑组织进行固定、切片后获得脑片；所述步骤1）中：只对无荧光的脑片进行染色，已表达免疫荧光蛋白的转基因动物的脑片无需染色。3.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤2）中，超快光清除方法具体为：将超快光清除试剂滴加到脑片上，孵育3min；其中，超快光清除试剂是尿素溶于二甲基亚砜溶剂中形成的混合试剂，尿素与二甲基亚砜溶剂的质量体积比是25％
‑
35％。4.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤2）中，光清除效果的量化评估方法具体为：2.1）将脑片置于透明培养皿中，培养皿置于黑色的拍摄背景上，采用白光照明，利用相机拍摄得到光清除前的脑片图像和光清除后的脑片图像；拍摄背景中心为黑色实心方框，中心黑框周边均是边框为黑色填充为白色的方格，培养皿放置于中心黑框上；2.2）利用拍摄背景方格的黑色边框和白色填充对拍摄的图像进行亮度归一化；2.3）对图像的中心黑框进行自动识别，找到中心黑框所在区域进行裁剪，得到裁剪后的图像b；2.4）对裁剪后的图像进行图像增强处理，以提高图像对比度，然后进行二值化；2.5）对二值化后的图像去孤点，得到图像e，图像e中的白色区域为第一次预识别的脑片区域；去孤点时，将黑色区域的阈值设置大于白色区域的阈值设置；2.6）对步骤2.3）的图像b进行处理，以增大脑片范围内和范围外的强度差异，具体为：将图像b中与图像e中白色区域对应的区域的坐标的数值增大至两倍以上；将图像b中与图像e中黑色区域对应的区域的坐标的数值减小至二分之一以下；2.7）对步骤2.6）处理后的图像进行降噪和二值化处理；2.8）对步骤2.7）得到的图像再去孤点即可得到脑片所在的区域，其中白色区域为脑区，黑色区域为非脑区，白色像素点总和即为脑片面积；将识别出的脑区所有像素点的亮度均值定义为I，非脑区所有像素点的亮度均值定义为I
b
，光清除效果T的定义为：
其中，I
o
、I
ob
分别为光清除前的脑区与非脑区所有像素点的亮度均值。5.根据权利要求1所述的高通量神经环路解析方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯科，徐晓滨，龚薇，段树民，吕杰，朱之京，
申请(专利权)人：良渚实验室，
类型：发明
国别省市：