Au-NaCl凝胶与DSAI标记的核酸适配体荧光传感器对AFB1的检测方法技术

本发明专利技术属于生物化学、环境检测和食品安全中对AFB1的检测技术领域，公开了Au

【技术实现步骤摘要】
Au
‑
NaCl凝胶与DSAI标记的核酸适配体荧光传感器对AFB1的检测方法


[0001]本专利技术属于生物化学、环境检测和食品安全等领域中对黄曲霉毒素B1(AFB1)的检测方法，基于Au
‑
NaCl凝胶与DSAI标记的核酸适配体荧光传感器对AFB1的检测。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素(AFT)是一种具有高毒性和致癌性，极易污染各种食品和农产品的真菌毒素，可在农业生产、加工、运输和储存过程中受到真菌毒素污染的饲料和食品中积累。其中AFB1最常见并且毒性和致癌性最强的真菌毒素，它会阻碍细胞内RNA的合成，以及它是肝细胞癌(HCC)以及生长抑制、免疫系统调节和营养不良的病原体。研究表明AFB1可从家禽饲料转移到鸡蛋、肉和其他可食用的部位，严重的污染了动物的食物供应，它不仅导致牲畜和家禽生产的巨大经济损失，还对人类健康构成风险。由于AFB1在农作物生产前后是不可避免的，在相当高的温度下，也难以被分解，从而很容易进入到食物链，被人体吸收。为了避免人和动物摄入AFB1，需要对农产品中的低浓度的AFB1需要有高灵敏性、快捷、方便的检测方法。
[0003]核酸适配体是一种能与多种目标物质高特异性、高选择性结合的寡核苷酸序列。适配体由于具有制备简便、特异性强、稳定性好等优点，已被广泛应用于生物传感器领域。贵金属凝胶是一个新型的功能性材料，兼具有贵金属独特的物理化学特性和整体多孔材料特性，由于其同时具有催化性能、大比表面积、自支撑结构以及三维多孔结构而被广泛研究。
[0004]传统的仪器分析方法虽然表现出优异的性能，但设备昂贵、对检测人员的技术要求较高，并且测定时间较长，不适合现场快速检测，对欠发达地区不友好。而其他的一些检测方法会出现假阳性，从而造成灵敏度较低的现象。因此开发一种简单、快速、高灵敏、高选择性的AFB1检测方法是一个必不可少的过程。

技术实现思路

[0005]为了降低AFB1的检测限，提高AFB1的灵敏性。本专利技术基于Au
‑
NaCl凝胶与具有聚集诱导发光效应的另一种AIE荧光团(DSAI)核酸适配体结合的生物传感器来检测AFB1。DSAI自身的铵阳离子与核酸适配体中的磷酸根阴离子的结合使生物传感平台携带稳定的荧光。基于Au
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NaCl凝胶的大表面积、三维多孔结构，Au
‑
NaCl凝胶表面的Au与核酸适配体上的巯基通过“Au
‑
S”共价结合，解决了因物理吸附可能会出现的假阳性信号，并且根据荧光共振能量转移(FRET)原理，荧光发生一定的降低。加入待测目标AFB1后，AFB1与核酸适配体之间发生特异性结合并发生构象上的改变，荧光发生恢复。相较于Au凝胶，加入引发剂NaCl到Au凝胶中调配其纳米线直径，提高了AFB1的检测的灵敏度与准确性。
[0006]Au
‑
NaCl凝胶与DSAI标记的核酸适配体荧光传感器对AFB1的检测方法，包括如下步骤：
[0007](1)设计末端具有巯基的DNA序列DNA
‑
SH，将DNA
‑
SH溶于Tris
‑
HCl溶液中；
[0008]步骤(1)中，Tris
‑
HCl溶液中，DNA
‑
SH的浓度为10μM；Tris
‑
HCl溶液的浓度为10mM；
[0009]DNA
‑
SH的序列为：5
’‑
SH
‑
GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CC
‑3’
；
[0010](2)Au
‑
NaCl凝胶材料的制备：
[0011]将柠檬酸钠溶液和HAuCl4溶液加入H2O中第一次搅拌15min；快速注射新制备的还原剂NaBH4水溶液，第二次搅拌30min；再加入引发剂NaCl溶液第三次搅拌10
‑
20s，静置6
‑
12h，得到水凝胶；
[0012]将制备好的水凝胶用大量的水洗涤数次，洗涤总时间持续2
‑
3天，用叔丁醇交换数次，然后放入冷冻干燥机中冷冻干燥12
‑
24h，得到Au
‑
NaCl凝胶固体；
[0013]称取一定量的Au
‑
NaCl凝胶固体，溶于水中，洗涤，除去溶液中的叔丁醇，得浓度为500μg/mL的Au
‑
NaCl凝胶溶液；
[0014]步骤(2)中，柠檬酸钠溶液、HAuCl4溶液、H2O、NaBH4水溶液、NaCl溶液的用量比为2.5mL：3.08mL：493mL：2mL：555μl；其中，柠檬酸钠溶液的浓度为400mM，HAuCl4溶液的浓度为32.5mM，NaBH4水溶液的浓度为200mM，NaCl溶液的浓度为1M；
[0015](3)淬灭：
[0016]将步骤(1)DNA
‑
SH的Tris
‑
HCl溶液、步骤(2)制备的Au
‑
NaCl凝胶溶液和Tris
‑
HCl缓冲液混合，混合液反应12h后，离心洗脱，得到基于Au
‑
NaCl凝胶的传感体系，测其荧光强度F0；
[0017]混合液中，DNA
‑
SH的浓度为10
‑
50nM；Au
‑
NaCl凝胶的浓度为0.4
‑
1.2μg/mL；所述的Tris
‑
HCl缓冲液的浓度为10mM，pH＝7.5。
[0018](4)检测：
[0019]将一定梯度浓度的AFB1加入步骤(3)所得Au
‑
NaCl凝胶的传感体系中，所得反应体系在室温下反应，测其荧光强度F，与淬灭后的荧光数值F0进行比较，得到荧光回复率F/F0‑
1，加入的AFB1浓度与荧光回复率呈一定的正比关系。
[0020]步骤(4)中，反应体系中，AFB1的浓度为0.01
‑
10pg/mL，反应时间为40min。本专利技术还制备了Au凝胶，用于对比；
[0021]将加入引发剂的Au
‑
NaCl凝胶对AFB1的检测与不加入引发剂的Au凝胶进行对比，发现本专利技术中加入引发剂的Au
‑
NaCl凝胶检测AFB1时的检测限远远低于不加入引发剂的Au凝胶，说明加入引发剂NaCl调控Au凝胶的纳米线直径会提高检测的灵敏度。
[0022]本专利技术具有以下优点
[0023](1)本专利技术原理简单，操作方便，省时省力，为食品安全检测AFB1带来了极大的便利。
[0024](2)本专利技术中的凝胶材料易于获得，制作方法简单，成本低，性质稳定。
[0025](3)本专利技术利用了凝胶材料中Au的物理化学本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Au
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NaCl凝胶与DSAI标记的核酸适配体荧光传感器对AFB1的检测方法，包括如下步骤：(1)设计末端具有巯基的DNA序列DNA
‑
SH，将DNA
‑
SH溶于Tris
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HCl溶液中；(2)Au
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NaCl凝胶材料的制备：将柠檬酸钠溶液和HAuCl4溶液加入H2O中第一次搅拌；快速注射新制备的还原剂NaBH4水溶液，第二次搅拌；再加入引发剂NaCl溶液第三次搅拌，静置，得到水凝胶；将制备好的水凝胶用大量的水洗涤数次，洗涤总时间持续2
‑
3天，用叔丁醇交换数次，然后放入冷冻干燥机中冷冻干燥，得到Au
‑
NaCl凝胶固体；称取一定量的Au
‑
NaCl凝胶固体，溶于水中，洗涤，除去溶液中的叔丁醇，得Au
‑
NaCl凝胶溶液；(3)淬灭：将步骤(1)DNA
‑
SH的Tris
‑
HCl溶液、步骤(2)制备的Au
‑
NaCl凝胶溶液和Tris
‑
HCl缓冲液混合，混合液反应后，离心洗脱，得到基于Au
‑
NaCl凝胶的传感体系，测其荧光强度F0；(4)检测：将一定梯度浓度的AFB1加入步骤(3)所得Au
‑
NaCl凝胶的传感体系中，所得反应体系在室温下反应，测其荧光强度F，与淬灭后的荧光数值F0进行比较，得到荧光回复率F/F0‑
1，加入的AFB1浓度与荧光回复率呈一定的正比关系，得线性方程。2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，Tris
‑
HCl溶液中，DNA
‑
SH的浓度为10μM；Tr...

【专利技术属性】
技术研发人员：高力，张瑶，李菁妍，时海霞，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：