同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法技术

本发明专利技术提供了同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法。同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法包括如下步骤：S1001：在设计目的基因片段PCR扩增反应引物前，选取酶切位点A、酶切位点A1、酶切位点B、酶切位点B1作为载体构建的酶切位点。目标基因片段扩增完成后，对载体和片段分开进行双酶切；本发明专利技术的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法选用同样的限制性酶切位点，同样的引物设计方法，同样的酶切方法，连接更多的基因片段，不会因为接口处原有的酶切位点消失，出现不能被之前的同尾酶中的任意一个限制性内切酶所识别的现象。的现象。的现象。

【技术实现步骤摘要】
同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法。

技术介绍

[0002]在载体构建多基因片段连接时，通常由于载体上酶切位点或者基因片段上的酶切位点的限制，导致酶切位点不够用，而无法完成多基因片段连接到同一个载体上。目前常用的方法是通过overlapping的方法将需要连接到载体上的多个基因片段先连在一起，形成一个大基因片段，再将大基因片段连接到载体上。但这种方法通常会导致最后形成的大基因片段长度太长，从而很难连接到载体上。
[0003]同尾酶是指一对或者多个不同的限制性内切酶，这一对或者多个不同的限制性内切酶能够识别不同的限制性内切酶识别位点，但却能对其所识别的位点切出相同的粘性末端。互为同尾酶的限制性内切酶酶切后的粘性末端可以经DNA连接酶连接，但接口处原有的酶切位点消失，不能被之前的同尾酶中的任意一个限制性内切酶所识别，存在载体构建多基因片段连接时酶切位点不够用的问题。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法，以解决载体构建多基因片段连接时酶切位点不够用的问题。
[0005]本专利技术其中一个实施例提供了同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法。
[0006]所述同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法包括如下步骤：
[0007]步骤1：在设计目的基因片段PCR扩增反应引物前，选取酶切位点A、酶切位点A1、酶切位点B、酶切位点B1作为载体构建的酶切位点；
[0008]所述酶切位点A和酶切位点A1为一对同尾酶所对应的识别位点；
[0009]所述酶切位点B和酶切位点B1为另一对同尾酶所对应的识别位点。
[0010]步骤2：在设计目的基因片段PCR扩增反应引物时，在正向引物上加上所述酶切位点A1、所述酶切位点A和酶切位点B，在反向引物上加上所述酶切位点B1；或者在正向引物上加上所述酶切位点A1，在反向引物上加上所述酶切位点B1、所述酶切位点B、所述酶切位点A；
[0011]所述酶切位点A、酶切位点A1、酶切位点B、酶切位点B1的位置顺序均为在引物上5'端至3'端的顺序，其中酶切位点A与酶切位点B的位置可互换。
[0012]步骤3：将PCR扩增得到的基因片段和载体分开用双酶切，载体用酶切位点A和酶切位点B对应的同尾酶酶切，基因片段用酶切位点A1和酶切位点B1对应的同尾酶酶切，并分别回收酶切产物用T4连接酶连接，得到新的载体；
[0013]所述得到的新载体上原有的酶切位点A和B消失，但又通过设计的PCR扩增引物引入了新的酶切位点A和B。
[0014]步骤4：用上述同样的方法，包括选用同样的限制性酶切位点，同样的引物设计方法，同样的酶切方法，连接更多的基因片段。
[0015]进一步地，所述同尾酶为限制性内切酶，同一对所述同尾酶对其对应的酶切位点酶切后得到的粘性末端相同。
[0016]进一步地，酶切后的产物使用DNA连接酶连接。
[0017]进一步地，步骤S1002中，所述酶切位点排布包括以下排布方式：
[0018]正向引物上5'至3'依次为酶切位点A1、酶切位点A、酶切位点B，反向引物上为酶切位点B1；
[0019]和/或，正向引物上5'至3'依次为酶切位点A1，反向引物上依次为酶切位点B1、酶切位点B、酶切位点A1。
[0020]进一步地，所述载体和基因片段的连接方法包括但不限于DNA连接酶连接、同源重组。
[0021]优选的，所述DNA连接酶为T4连接酶。
[0022]进一步地，所述同尾酶包括但不限于BamHI/BglI、SalI/XhoI、PstI/NsiI、XbaI/SpeI。
[0023]进一步地，本专利技术的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法选用同样的限制性酶切位点，同样的引物设计方法，同样的酶切方法，连接更多的基因片段，不会因为接口处原有的酶切位点消失，出现不能被之前的同尾酶中的任意一个同尾酶所识别的现象。
[0024]进一步地，本专利技术的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法可被广泛用于多个物种基因的功能研究、遗传改造以及分子育种等，在基础研究和农业生产上都具有十分重要的价值。
[0025]以上实施例所提供的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法具有以下有益效果：
[0026]1、本专利技术方法利用同尾酶的特性，选择空白载体上两个合适的同尾酶对应的酶切位点A和酶切位点B作为载体构建用的酶切位点；并在设计目标基因片段PCR扩增引物时，在正向引物和反向引物上加上相应的酶切位点；在目标基因片段扩增完成后，对载体和基因片段分开进行双酶切，载体用同尾酶A和同尾酶B进行双酶切，基因片段用同尾酶A1和同尾酶B1进行双酶切；酶切完后分别回收连接；在连接第二个基因片段甚至更多基因片段时用同样的方法同样的酶切位点进行引物的设计和酶切连接，从而达到酶切位点无限使用的目的，可以简化构建流程，提高构建效率，提高载体构建的灵活性。
[0027]2、同时本专利技术的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法可被广泛用于多个物种基因的功能研究、遗传改造以及分子育种等，在基础研究和农业生产上都具有十分重要的价值。
[0028]3、同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法选用同样的限制性酶切位点，同样的引物设计方法，同样的酶切方法，连接更多的基因片段，不会因为接口处原有的酶切位点消失，出现不能被之前的同尾酶中的任意一个同尾酶所识别的现象。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0030]图1为引物对P1/P2和P3/P4的序列结构图；
[0031]图2为新载体结构的序列结构图；
[0032]图3为第二轮新载体结构的序列结构图；
[0033]图4为第n轮新载体结构的序列结构图；
[0034]图5为同尾酶识别序列及切开的粘性末端的序列结构图。
具体实施方式
[0035]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0036]需要说明，若本专利技术实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后
……
)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
[0037本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：S1001：选取酶切位点A、酶切位点A1、酶切位点B、酶切位点B1作为载体构建的酶切位点；S1002：在设计目标基因片段的PCR扩增引物时，在正向引物上加上所述酶切位点A1、所述酶切位点A、所述酶切位点B，反向引物上加上所述酶切位点B1；S1003：PCR扩增所述目标基因片段，将所述基因片段和所述载体使用同尾酶分开进行双酶切。2.如权利要求1所述的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法，其特征在于，步骤S1002中，在设计所述目标基因片段的PCR扩增引物时，还可以在正向引物上加上所述酶切位点A1，反向引物上加上所述酶切位点B1、所述酶切位点B、所述酶切位点A。3.如权利要求1所述的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法，其特征在于，步骤S1003中，所述载体使用同尾酶A和同尾酶B进行酶切。4.如权利要求1所述的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法，其特征在于，步骤S1003中，所述基因片段使用同尾酶A1和同尾酶B1进行酶切。5.如权利要求1所述的同尾酶在载体构建多基因片段连接中的应用方法，其特征在于，所述酶切位点A和所述酶切位点A1为一对同尾酶的两个酶切位点；所述酶切位点B和所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张胜南，吴子豪，鲁立，欧雅莉，郭鹏程，张织，邓红梅，李嫦，宾桂青，
申请(专利权)人：肇东星湖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：