一种高效表达猪PFKFB3基因的真核表达载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高效表达猪PFKFB3基因的真核表达载体及其构建方法，属于分子生物学领域。针对PFKFB家族PFKFB3基因的克隆及真核表达载体构建，设计含特定酶切位点和保护碱基的特异引物，应用PrimerSTAR高保真酶克隆获取特异编码序列，构建PFKFB3基因重组质粒，特异酶切处理并与线性化载体连接获得高效表达猪PFKFB3基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达猪PFKFB3基因的真核表达载体及其构建方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种高效表达猪PFKFB3基因的真核表达载体及其构建方法。

技术介绍

[0002]PFKFB3基因属PFKFB家族成员，是血管内皮细胞中表达量最高的一种糖酵解酶，能够将6
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磷酸果糖转化成2，6
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二磷酸果糖。已证实PFKFB家族对一些肿瘤的发生、发展起重要的作用。有关PFKFB3基因的报道多集中在人药物代谢和肿瘤发生过程，通过酶活性、mRNA表达和基因水平探讨PFKFB3对有氧糖酵解的调控作用。PFKFB3主要是通过介导F2、6P的水平来调控糖酵解过程，在肿瘤细胞的“Warburg效应”和肿瘤生长中扮演重要角色，另外，在糖酵解、血管生成和肿瘤发展过程中PFKFB3的磷酸化水平明显升高。PFKFB3促进细胞周期进展，并抑制细胞凋亡。当下调肿瘤细胞中的PFKFB3表达水平时，细胞周期发生阻滞，最终导致细胞凋亡。由此可见，抑制肿瘤细胞中PFKFB3的表达可以阻断糖酵解途径，阻滞细胞周期，从而抑制肿瘤细胞的生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达猪PFKFB3基因的真核表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)猪PFKFB3基因的克隆以健康猪肺组织为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以GenBank中猪PFKF B3基因cDNA序列NCBI reference sequence:XM_013980318.2为模板，设计包含特异酶切位点和保护碱基的特异引物，应用Primer STARMax高保真酶对猪PFKFB3基因序列进行PCR扩增，扩增片段包含猪PFKFB3基因cDNA序列1563bp，酶切位点及保护碱基18bp，片段总长1581bp，所述猪PFKFB3基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示；2)真核表达载体pcDNA3.1(+)
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PFKFB3的构建将PFKFB3基因连接到pMD18
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T载体中，转化至DH5α大肠杆菌，提取菌株中pMD18
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T
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PFKFB3重组质粒，Kpn I/Xho I双酶切鉴定后回收PFKFB3基因片段，同时用Kpn I/Xho I双酶切处理pcDNA3.1(+)载体质粒，利用T4连接酶与回收的PFKFB3基因片段进行连接，然后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，提取阳性质粒，测序验证，得到高效表达猪PFKFB3基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈洪博，颜璐琦，邵丹，黄敏，江潜城，段滇宁，
申请(专利权)人：龙岩学院，
类型：发明
国别省市：