OXT基因编辑模型犬的建立方法技术

本发明专利技术涉及用于建立OXT基因编辑模型犬的方法，具体涉及利用基因编辑技术制备OXT基因敲除型疾病OXT基因编辑模型犬的方法，以及获得的OXT基因敲除型OXT基因编辑模型犬及其细胞、组织和器官，使利用犬作为社交行为机制研究动物模型研究变得可行。究动物模型研究变得可行。

【技术实现步骤摘要】
OXT基因编辑模型犬的建立方法


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及OXT基因编辑模型犬的建立方法，尤其是涉及利用基因编辑技术制备OXT基因敲除型模型犬的方法。

技术介绍

[0002]社交认知是开展一系列社会交往(比如配偶选择、伴侣偏好和母子间亲密行为等)的基础。神经肽催产素(oxytocin,OXT)在社会行为中的作用是社会神经科学领域最早和最重要的发现之一。大量的研究发现催产素对诸如人类的信任、共情、情绪识别、自闭特质、社会性信息加工等社会认知与情感行为发挥着重要作用。OXT缺乏导致人的社会记忆和交往行为减弱、暴饮暴食，是引起肥胖的一个重要诱因。有相关研究已经将催产素应用到了精神分裂症、焦虑症、抑郁症和创伤后应激障碍的治疗之中。催产素是社会认知过程的重要调节器，还需要进一步来解析催产素对社会感知、认知和人际行为的调控机制。
[0003]催产素系统可能在犬从狼驯化的过程中发挥重要作用。犬已经进化出独特的人类模拟社交技能，使它们能够有效地与人沟通和合作。犬的类似人类的交流方式，包括相互凝视，可能是在驯养过程中获得的。催产素受体(OXTR)基因周围区域的基因组差异以前与犬的交流技能的差异有关。鼻内催产素治疗、OXTR多态性及其相互作用与犬和人类的跨物种社会认知相关。犬与人类脑功能对比研究对揭示人类社会情感交流机制等具有重要的科学价值。
[0004]目前广泛应用于社交行为机制研究的啮齿动物模型，在进化上与人类早在1亿年前就已分开，啮齿动物和人类在大脑结构和功能上存在巨大差别。前期小鼠模型表型分析结果表明，OXT基因缺失后小鼠的社会记忆能力存在缺陷，但是空间记忆和行为抑制能力是完好无损的。非人灵长类是用于社交行为机制研究的理想建模动物，但该模型也存在一定局限性，如开发技术难度高、繁殖速度慢等。同时，非人灵长类动物的个体差异显著、动物伦理和动物保护等问题制约了该类模型的广泛应用，且目前没有可供该基因研究的非人灵长类动物模型。因此，需要开发新的动物模型，用于开展社交行为机制研究及药物研发。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种经基因编辑技术建立OXT(神经肽催产素)基因敲除的OXT基因编辑模型犬的方法。本专利技术还涉及所建立的OXT基因敲除型OXT基因编辑模型犬及其细胞和组织。
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种OXT基因编辑模型犬的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得OXT基因敲除的犬受精卵或犬体细胞。
[0007]在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。
[0008]在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0009](1)根据犬OXT基因的1号外显子和2号外显子的序列确定打靶位点；
[0010](2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；
[0011](3)通过体外转录，分别获得sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物；
[0012](4)将步骤(3)获得的sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物导入犬受精卵或犬体细胞中，获得OXT基因敲除的犬受精卵或犬体细胞。
[0013]在一些实施方式中，根据OXT基因序列的3号外显子确定3个打靶位点。
[0014]优选地，所述sgRNA及其互补序列包括以下序列：
[0015]S1位点：ACCCGCTGTGACCAGCCATGCGG(SEQ ID NO:2)，互补序列为：CCGCATGGCTGGTCACAGCGGGT(SEQ ID NO:3)；
[0016]S2位点：GCAGTTCTGGATGTAGCAGGCGG(SEQ ID NO:4)，互补序列为：CCGCCTGCTACATCCAGAACTGC(SEQ ID NO:5)；
[0017]S3位点：TTCGGGCCCAGCATCTGCTGCGG(SEQ ID NO:6)，互补序列为：CCGCAGCAGATGCTGGGCCCGAA(SEQ ID NO:7)。
[0018]在一些实施方式中，所述犬体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。
[0019]在一些实施方式中，所述犬体细胞选自胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。
[0020]在一些实施方式中，所述方法还包括将获得的OXT基因敲除的犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备OXT基因编辑模型犬。
[0021]在一些实施方式中，所述方法还包括将获得的OXT基因敲除的犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬的输卵管内，从而制备OXT基因编辑模型犬。
[0022]在一些实施方式中，本专利技术利用基因编辑技术，根据犬OXT基因序列的外显子选择打靶位点序列，并且根据打靶位点序列构建了sgRNA打靶载体和CRISPR/Cas9表达载体，载体经验证有效后，体外转录为mRNA，然后采用胞质注射的方式将mRNA注射入犬受精卵中，然后将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备OXT基因敲除型OXT基因编辑模型犬。
[0023]在第二方面，本专利技术提供了由第一方面的方法获得的OXT基因编辑模型犬的犬体细胞、组织或器官。
[0024]在一些实施方式中，所述犬体细胞、组织或器官包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17所示的序列中的至少一个。
[0025]在第三方面，本专利技术提供了犬OXT基因敲除的打靶载体，所述打靶载体由针对犬OXT基因1号外显子和2号外显子中的打靶位点序列设计的sgRNA序列以及骨架载体构成。
[0026]在一些实施方式中，所述sgRNA及其互补序列包括以下序列：
[0027]S1位点：ACCCGCTGTGACCAGCCATGCGG(SEQ ID NO:2)，互补序列为：CCGCATGGCTGGTCACAGCGGGT(SEQ ID NO:3)；
[0028]S2位点：GCAGTTCTGGATGTAGCAGGCGG(SEQ ID NO:4)，互补序列为：CCGCCTGCTACATCCAGAACTGC(SEQ ID NO:5)；
[0029]S3位点：TTCGGGCCCAGCATCTGCTGCGG(SEQ ID NO:6)，互补序列为：CCGCAGCAGATGCTGGGCCCGAA(SEQ ID NO:7)。
[0030]在第四方面，本专利技术提供了一种引物对，所述引物对的序列如下：
[0031]正向引物：GTAACCCTTCCCCCAGATGC(SEQ ID NO:8)；和
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于建立OXT基因编辑模型犬的方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得OXT基因敲除的犬受精卵或犬体细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据犬OXT基因的1号外显子和2号外显子的序列确定打靶位点；(2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，将合成的sgRNA序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；(3)通过体外转录，分别获得sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物；(4)将步骤(3)获得的sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物导入犬受精卵或犬体细胞中，获得OXT基因敲除的犬受精卵或犬体细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，根据犬OXT基因序列的1号外显子和2号外显子的序列确定3个打靶位点，优选地，所述打靶位点的sgRNA序列及其互补序列包括：S1位点：ACCCGCTGTGACCAGCCATGCGG(SEQ ID NO:2)，互补序列为：CCGCATGGCTGGTCACAGCGGGT(SEQ ID NO:3)；S2位点：GCAGTTCTGGATGTAGCAGGCGG(SEQ ID NO:4)，互补序列为：CCGCCTGCTACATCCAGAACTGC(SEQ ID NO:5)；S3位点：TTCGGGCCCAGCATCTGCTGCGG(SEQ ID NO:6)，互补序列为：CCGCAGCAGATGCTGGGCCCGAA(SEQ ID NO:7)。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述犬体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将获得的OXT基因敲除的犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备OXT基因编辑模型犬。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将获得的OXT基因敲除的犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受...

【专利技术属性】
技术研发人员：米继东，赵建平，张永清，徐惠娟，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：