一种烟草链霉菌及其分离方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种烟草链霉菌(Streptomycestabaci)及其分离方法和应用，该放线菌的微生物学分类命名为烟草链霉菌N35，拉丁文学名：Streptomycestabaci N35，已于2021年10月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC4.7701。本发明专利技术从烟草根际土壤样品中分离得到的链霉菌N35菌株，具有降解纤维素和蛋白质的功能，制备的生物香料加入到卷烟烟丝中，对卷烟抽吸品质具有正向提升功能，提升香气丰富性，同时增加抽吸的细腻感和柔和感。同时增加抽吸的细腻感和柔和感。同时增加抽吸的细腻感和柔和感。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草链霉菌及其分离方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有产香功能的微生物烟草链霉菌及其分离方法和应用。

技术介绍

[0002]目前，烟用香精香料主要是通过各种分离手段直接从烟草和其它植物中提取或采用化学方法合成，然而这两种方法受原料来源、合成方法及条件等的制约。随着人们对健康生活的关注，天然香料的应用越来越受欢迎，微生物发酵香料属于天然等同香料，其利用微生物发酵过程中可以产生很多如酯类、酸类和羧基化合物等香味物质，可得到风格独特的香料。
[0003]链霉菌是一类具有强大次级代谢能力的放线菌，能够利用其初级代谢产生的前体化合物和能量，合成多种结构复杂、功能多样的具有生物活性的次级代谢产物，包括各种抗生物质、生长调节类物质及分解酵素等。链霉菌的生命周期比一般细菌长，主要包括孢子萌发、基内菌丝生长、气生菌丝生长、孢子链的形成及产生成熟的孢子，然后进入下一轮的生长过程，链霉菌独特的生活方式有助于其在自然环境中生存。链霉菌在抗生素及植物保护方面研究较多，但在香料开发方面较少见。
[0004]为了解决以上问题，提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利利用从烟草根际土壤中分离得到的烟草链霉菌N35菌株，发酵制备生物香料，并应用于卷烟烟丝中，提升香气丰富性，同时增加抽吸的细腻感和柔和感。
[0006]*除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为质量百分数。
[0007]本专利技术第一方面涉及一种具有产香功能的微生物烟草链霉菌N35，其是从云南昆明烟草种植基地烟草根际土壤样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明其属于链霉菌，微生物学分类命名为Streptomyces tabaciN35，已于2021年10月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 4.7701，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
[0008]本专利技术分离得到的烟草链霉菌N35菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在R2A培养基上形成分枝状的基内菌丝和气生菌丝，菌落呈白色。酪蛋白水解、纤维素水解、吐温20，40，60和80水解呈阳性，淀粉水解呈阴性，不产生吲哚。能利用α
‑
乳糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、甘露糖、果糖、山梨醇、半乳糖、鼠李糖、肌醇。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和一个未知的磷脂，细胞的呼吸醌为甲基萘醌
‑
9(MK
‑
9(H8))。
[0009]本专利技术所分离得到的微生物烟草链霉菌N35的16S rDNA基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MT598006。
[0010]本专利技术第二方面涉及一种分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草链霉菌
N35的方法，包括以下步骤：
[0011]a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，加无菌水继续稀释并涂布于LB平板培养基上进行培养，挑选单菌落，纯化，得到分离的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中备用；
[0012]b、将步骤a分离的微生物菌液接种到LB液体培养基中，摇床振荡，培养至菌液浓度为光密度OD＝2.0，制得种子液；
[0013]c、将步骤b制得的种子液接种在筛选培养基中，摇床振荡，筛选产生香气的微生物，构建系统发育树进行分子鉴别。
[0014]上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草链霉菌N35的方法，步骤a中的土壤样品取自云南昆明烟草种植基地。
[0015]上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草链霉菌N35的方法，步骤a中LB平板培养基的组成如下：每950mL双蒸水(ddH2O)中加入：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；，调节pH至7.2，定容至1000mL，121℃，20min高压灭菌，待冷却至50
‑
60℃时，倒制平板。
[0016]上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草链霉菌N35的方法，步骤a中摇床振荡温度为30℃，振荡速度180rpm，振荡时间30min，用无菌水稀释至10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5倍，在LB平板培养基上的培养温度为30℃，培养时间48h，甘油的加入量为分离的微生物菌液体积的20％，冰箱温度为
‑
80℃。
[0017]上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草链霉菌N35的方法，步骤b中LB液体培养基的组成如下：每950ml双蒸水(ddH2O)中加入胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；调节PH至7.0，定容至1000mL，121℃，20min高压灭菌。
[0018]上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草链霉菌N35的方法，步骤b中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm；步骤c中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm，振荡时间3
‑
5天。
[0019]上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的烟草链霉菌N35的方法，步骤c中筛选培养基为R2A液体培养基，组成如下：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000ml，pH7.2。
[0020]本专利技术第三方面涉及一种利用本专利技术第一方面所述的烟草链霉菌N35发酵制备生物香料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0021]将烟草链霉菌N35扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养6天，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩后所得澄清红棕色液体，即为生物香料。
[0022]优选地，将烟草链霉菌N35经过试管斜面培养和种子培养后接种于发酵培养基中。
[0023](1)试管斜面培养
[0024]采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种烟草土壤戴氏菌L4
‑
6菌株，28℃下培养1周，获得试管菌种；
[0025](2)种子培养
[0026]采用种子培养基，种子培养基的配方为：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β
‑
丙氨酸5g，硫酸镁0.5g，磷酸铵0.2g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草链霉菌，其特征在于，其微生物学分类命名为烟草链霉菌N35，拉丁文学名：StreptomycestabaciN35，已于2021年10月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC4.7701。2.一种分离、培养和鉴别权利要求1所述的烟草链霉菌N35的方法，包括以下步骤：a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，加无菌水继续稀释并涂布于LB平板培养基上进行培养，挑选单菌落，纯化，得到分离的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中备用；b、将步骤a分离的微生物菌液接种到LB液体培养基中，摇床振荡，培养至菌液浓度为光密度OD＝2.0，制得种子液；c、将步骤b制得的种子液接种在筛选培养基中，摇床振荡，筛选产生香气的微生物，构建系统发育树进行分子鉴别。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a中的土壤样品取自云南昆明烟草种植基地。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a中LB平板培养基的组成如下：每950mL双蒸水(ddH2O)中加入：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；，调节pH至7.2，定容至1000mL，121℃，20min高压灭菌，待冷却至50
‑
60℃时，倒制平板。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a中摇床振荡温度为30℃，振荡速度180rpm，振荡时间30min，用无菌水稀释至10
‑1、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀明，段焰青，李源栋，刘志华，胡瑞林，李文均，李先毅，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：