一种新型酰胺酶显色底物及其合成方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种新型酰胺酶显色底物及其合成方法与应用，该合成方法包括以下步骤：步骤S1、在圆底烧瓶中加入I结构化合物氨噻肟酸与有机溶剂，缓慢滴加氯酰化剂，加毕，控温反应得到含有氨噻肟酰氯的黄色澄清溶液II；步骤S2、将反应液置于旋转蒸发仪中，以蒸发除去溶剂，生成黄色流状液体，向黄色流状液体中加入5

【技术实现步骤摘要】
一种新型酰胺酶显色底物及其合成方法与应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，特别涉及一种新型酰胺酶显色底物及其合成方法与应用。

技术介绍

[0002]酰胺酶(Amidase，EC 3.5.1.4)是一类催化酰胺C
‑
N键水解生成相应羧酸和氨的重要生物催化剂。该酶促反应的本质是催化酰基从其供体(底物酰胺)向受体(如共底物水)的转移。因此，当体系中存在比水更强的亲核试剂如羟胺或肼为受体时，可生成氧肟酸或酰基肼，酰胺酶底物谱极广，能高效催化各种非天然脂肪族、杂环族及芳香族酰胺的水解，并具有高度化学选择性、区域选择性、立体选择性和不需辅酶等优点。大量研究表明，在其与腈水合酶(Nitrile hydratase，EC 4.2.1.84)耦联的腈立体选择性生物转化中，手性识别行为决定于酰胺水解步骤。酰胺酶对映选择性生物催化在复杂结构手性羧酸、氧肟酸及酰胺衍生物的合成中显示出巨大潜力，成为手性生物催化的重要工具酶。对于特定的生物催化过程，合适、高效的生物催化剂，尤其是立体选择性生物催化剂的发现是最为关键的一步。由于传统的气相色谱与高效液相色谱的筛选方法逐一测定大量样品的活性及立体选择性十分费时费力，因此开发快速、准确的头孢菌素酰胺酶筛选方法尤为迫切。
[0003]目前，头孢菌素类抗生素水解酶，如青霉素G酰化酶(PGA)的酶活测定方法已有文献报道，青霉素G酰化酶(PGA)测活底物2
‑
硝基
‑5‑
苯乙酰胺基苯甲酸(NIPAB)经水解后生成苯乙酸和5
‑r/>氨基
‑2‑
硝基苯甲酸(ANBA)，可用分光光度计在波长405nm处检测，该法灵敏度好、步骤短，有效解决了底物干扰问题。但是，原NIPAB法基于一定时间内酶反应为零级反应，常用乙醇为终止剂，反应终止效果与杂质将会影响检测结果，从而对筛选的准确度与效率产生影响。
[0004]
技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术存在的不足，提供了一种新型酰胺酶显色底物及其合成方法与应用，具体技术方案如下：
[0006]本专利技术提供了一种新型酰胺酶显色底物的合成方法，该合成方法包括以下步骤：
[0007]步骤S1、首先，在圆底烧瓶中加入I结构化合物氨噻肟酸与有机溶剂，然后，控温0
‑
5℃下，缓慢滴加氯酰化剂，加毕，控温反应1
‑
2h得到含有氨噻肟酰氯的黄色澄清溶液II；
[0008]步骤S2、首先，将步骤S1的反应液置于旋转蒸发仪中，以蒸发除去溶剂，生成黄色流状液体，然后，向含有氨噻肟酸酰氯的黄色流状液体中加入5
‑
氨基
‑2‑
硝基苯甲酸与丙酮，充分搅拌后，控温0
‑
5℃下，滴加有机碱或无机碱，继续保温反应1
‑
3h，反应结束后旋蒸
除去溶剂，加入适量蒸馏水充分搅拌，用酸化剂调节pH为2
‑
3，析出黄色固体，混匀离心，最后，通过常规的过滤、洗涤与干燥得到目标产物III。
[0009]作为本专利技术一种优选技术方案，所述步骤1中的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮与甲苯中的一种或多种混合。
[0010]作为本专利技术一种优选技术方案，所述步骤1中的氯酰化剂为草酰氯、氯化亚砜、甲磺酰氯中的一种。
[0011]作为本专利技术一种优选技术方案，所述步骤1中，氨噻肟酸的质量与有机溶剂的体积比为1：(15～35)，单位为g/mL；氨噻肟酸与氯酰化剂的摩尔比为1：(1～1.6)。
[0012]作为本专利技术一种优选技术方案，所述步骤1中，氯酰化剂需在控温0
‑
5℃下，溶解于N,N
‑
二甲基甲酰胺中，且氯酰化剂与N,N
‑
二甲基甲酰胺的摩尔比为1：(1.1～1.5)。
[0013]作为本专利技术一种优选技术方案，所述步骤2中，氨噻肟酸酰氯与5
‑
氨基
‑2‑
硝基苯甲酸的摩尔比为1：(0.8
‑
1.2)；氨噻肟酸与有机碱的摩尔比为1：(1.2～1.6)。
[0014]作为本专利技术一种优选技术方案，所述步骤2中，有机碱为三乙胺、四甲基胍与二乙胺中的一种或多种混合；无机碱为氢氧化钠、碳酸钠与碳酸氢钠中的一种或多种混合。
[0015]本专利技术还提供了一种新型酰胺酶显色底物，所述新型酰胺酶显色底物命名为(E)
‑5‑
(2
‑
(2
‑
氨基噻唑
‑4‑
基)
‑2‑
(甲氧基亚氨基)乙酰氨基)
‑2‑
硝基苯甲酸，分子式为C
13
H
11
N5O6S，分子量为365.32，结构式如下：
[0016][0017]本专利技术还提供了一种新型酰胺酶显色底物在第三代头孢菌素酰胺水解酶的筛选途径中的应用。
[0018]作为本专利技术一种优选技术方案，所述第三代头孢菌素酰胺水解酶的酶活测定方法如下：
[0019]制定ANBA
‑
OD
405
标准曲线：用50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)对ANBA进行梯度稀释(0、4、8、12、16、20、24、28、32mg/L)，浓度梯度作为横坐标，以405nm条件下测定的OD值为纵坐标，绘制标准曲线；
[0020]其中，酶活力定义为37℃条件下，1min分解1μmol新型酰胺酶显色底物所需的酰胺酶量为一个酶活力单位；
[0021]来自不同菌株的粗酶液酰胺酶活力值U参照下面公式计算：U＝OD
405/
T
×
V
×
k，T为反应时间(min)，V为酶液样品体积(mL)，k为标准曲线斜率。
[0022]本专利技术的有益效果是：
[0023]1、本专利技术中设计的基于改良NIPAB法的新型测活底物与探针底物，相比于2
‑
硝基
‑5‑
苯乙酰胺基苯甲酸(NIPAB)，其反应后的显色产物ANBA也可利用分光光度计在405nm处测得，在酶活定量与筛选中具有灵敏度高、准确性好的优势；
[0024]2、本专利技术中不需要终止剂，相较于NIPAB法中的终止剂乙醇，其具有步骤简单与反
应温和等优点；
[0025]3、本专利技术中有效解决了底物干扰问题，底物经反应后无杂质生成，对检测结果不会造成影响；
[0026]4、本专利技术为第三代头孢菌素酰胺水解酶的筛选提供参考与借鉴。
附图说明
[0027]图1示出了本专利技术中新型酰胺酶显色底物的核磁共振氢谱图；
[0028]图2示出了本专利技术中新型酰胺酶显色底物的傅立叶红外光谱图；
[0029]图3示出了本专利技术中新型酰胺酶显色底物的ESI
‑
MS高分辨率质谱图；
[0030]图4示出了本专利技术中新型酰胺酶显色底物的MALDI质谱分析图。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型酰胺酶显色底物的合成方法，其特征在于，该合成方法包括以下步骤：步骤S1、首先，在圆底烧瓶中加入I结构化合物氨噻肟酸与有机溶剂，然后，控温0
‑
5℃下，缓慢滴加氯酰化剂，加毕，控温反应1
‑
2h得到含有氨噻肟酰氯的黄色澄清溶液II；步骤S2、首先，将步骤S1的反应液置于旋转蒸发仪中，以蒸发除去溶剂，生成黄色流状液体，然后，向含有氨噻肟酸酰氯的黄色流状液体中加入5
‑
氨基
‑2‑
硝基苯甲酸与丙酮，充分搅拌后，控温0
‑
5℃下，滴加有机碱或无机碱，继续保温反应1
‑
3h，反应结束后旋蒸除去溶剂，加入适量蒸馏水充分搅拌，用酸化剂调节pH为2
‑
3，析出黄色固体，混匀离心，最后，通过常规的过滤、洗涤与干燥得到目标产物III。2.根据权利要求1所述的一种新型酰胺酶显色底物的合成方法，其特征在于：所述步骤1中的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮与甲苯中的一种或多种混合。3.根据权利要求1所述的一种新型酰胺酶显色底物的合成方法，其特征在于：所述步骤1中的氯酰化剂为草酰氯、氯化亚砜、甲磺酰氯中的一种。4.根据权利要求1所述的一种新型酰胺酶显色底物的合成方法，其特征在于：所述步骤1中，氨噻肟酸的质量与有机溶剂的体积比为1：(15～35)，单位为g/mL；氨噻肟酸与氯酰化剂的摩尔比为1：(1～1.6)。5.根据权利要求1所述的一种新型酰胺酶显色底物的合成方法，其特征在于：所述步骤1中，氯酰化剂需在控温0
‑
5℃下，溶解于N,N
‑
二甲基甲酰胺中，且氯酰化剂与N,N
‑
二甲基甲酰胺的摩尔比为1：(1.1～1.5)。6.根据权利要求1所述的一种新型酰胺酶显色底物的合成方法，其特征在于：所述步骤2中，氨噻肟酸酰氯与5
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【专利技术属性】
技术研发人员：章艺，徐毅，吴小梅，马宝娣，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：