【技术实现步骤摘要】
构建PAH基因突变的苯丙酮尿症模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
[0001]本专利技术属于生物
,具体属于基因编辑
,更具体涉及构建PAH基因突变的苯丙酮尿症模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。
技术介绍
[0002]苯丙酮尿症是一种常染色体隐性遗传的L
‑
苯丙氨酸代谢病,其是由于PAH基因的突变导致部分或完全缺乏苯丙氨酸羟化酶的活性,使得苯丙氨酸无法正常转化为酪氨酸。这种代谢错误不仅会导致苯丙氨酸及其次级代谢产物酮酸在体内堆积,还会造成血液和大脑中酪氨酸浓度的降低,导致神经退行性疾病及智力缺陷等症状。在全球范围内,苯丙酮尿症的发病率约为1:8000。目前,苯丙酮尿症患者一旦确诊,需要终生接受监测和治疗,以减缓相关神经退行性疾病的发展。
[0003]研究苯丙酮尿症的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行,目前常用的动物模型为小鼠模型,然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大,不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物,其体型大小和生理功能与人类近似,易于大规模繁殖饲养,而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低,是理想的人类疾病模型动物。
[0004]基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术,其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术,其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前,基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。 />
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供构建PAH基因突变的苯丙酮尿症模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。
[0006]本专利技术提供了一种试剂盒,包括PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白。
[0007]本专利技术还提供了一种试剂盒,包括PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和PRONCN蛋白。
[0008]本专利技术还提供了一种试剂盒,包括PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和特异质粒。
[0009]以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。
[0010]本专利技术提供了PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0011]本专利技术还提供了PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术还提供了PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和特异质粒在制备试剂盒中的应用。
[0013]以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c):(a)制备重组细胞;(b)制备苯丙酮尿症模型猪;(c)制备苯丙酮尿症细胞模型或苯丙酮尿症组织模型或苯丙酮尿症器官模型。
[0014]本专利技术提供了一种制备重组细胞的方法,包括如下步骤:将PAH
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gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞,得到重组细胞。
[0015]所述共转染具体采用电击转染的方式。
[0016]电击转染的参数设置具体可为:1450V、10ms、3pulse。
[0017]所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪。
[0018]PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白的配比依次为:0.8
‑
1.2μg PAH
‑
gRNA1:0.8
‑
1.2μg PAH
‑
gRNA4:3
‑
5μg NCN蛋白。
[0019]PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白的配比依次为:1μg PAH
‑
gRNA1:1μg PAH
‑
gRNA4:4μg NCN蛋白。
[0020]猪细胞、PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白的配比依次为:10万个猪细胞:0.8
‑
1.2μg PAH
‑
gRNA1:0.8
‑
1.2μg PAH
‑
gRNA4:3
‑
5μg NCN蛋白。
[0021]猪细胞、PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白的配比依次为:10万个猪细胞:1μg PAH
‑
gRNA1:1μg PAH
‑
gRNA4:4μg NCN蛋白。
[0022]以上任一所述PAH
‑
gRNA1为sgRNA,其靶序列结合区如SEQ ID NO:16中第3
‑
22位核苷酸所示。
[0023]具体的,所述PAH
‑
gRNA1如SEQ ID NO:16所示。
[0024]具体的,所述PAH
‑
gRNA1如SEQ ID NO:10所示。
[0025]以上任一所述PAH
‑
gRNA4为sgRNA,其靶序列结合区如SEQ ID NO:17中第3
‑
22位核苷酸所示。
[0026]具体的,所述PAH
‑
gRNA4如SEQ ID NO:17所示。
[0027]具体的,所述PAH
‑
gRNA4如SEQ ID NO:13所示。
[0028]以上任一所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。
[0029]具体的,所述NCN蛋白如SEQ ID NO:3所示。
[0030]以上任一所述猪细胞为猪成纤维细胞。
[0031]以上任一所述猪细胞为猪原代成纤维细胞。
[0032]以上任一所述猪细胞为获自初生猪的猪原代成纤维细胞。
[0033]所述NCN蛋白的制备方法包括如下步骤:
[0034](1)将质粒pKG
‑
GE4导入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌;
[0035](2)采用液体培养基30℃培养所述重组菌,然后加入IPTG并进行25℃诱导培养,然后收集菌体;
[0036](3)将收集的菌体进行菌体破碎,收集粗蛋白溶液;
[0037](4)采用亲和层析从所述粗蛋白溶液中纯化具有His6标签的融合蛋白;
[0038](5)采用具有His6标签的肠激酶酶切具有His6标签的融合蛋白,然后采用Ni
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种试剂盒,包括PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白;所述PAH
‑
gRNA1为sgRNA,其靶序列结合区如SEQ ID NO:16中第3
‑
22位核苷酸所示;所述PAH
‑
gRNA4为sgRNA,其靶序列结合区如SEQ ID NO:17中第3
‑
22位核苷酸所示;所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白;所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c):(a)制备重组细胞;(b)制备苯丙酮尿症模型猪;(c)制备苯丙酮尿症细胞模型或苯丙酮尿症组织模型或苯丙酮尿症器官模型。2.一种试剂盒,包括PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和PRONCN蛋白;PAH
‑
gRNA1为权利要求1中所述的PAH
‑
gRNA1;PAH
‑
gRNA4为权利要求1中所述的PAH
‑
gRNA4;所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件:信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号;所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c):(a)制备重组细胞;(b)制备苯丙酮尿症模型猪;(c)制备苯丙酮尿症细胞模型或苯丙酮尿症组织模型或苯丙酮尿症器官模型。3.一种试剂盒,包括PAH
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gRNA1、PAH
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gRNA4和特异质粒;PAH
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gRNA1为权利要求1中所述的PAH
‑
gRNA1;PAH
‑
gRNA4为权利要求1中所述的PAH
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gRNA4;所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件:启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子;所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件:信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号;所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c):(a)制备重组细胞;(b)制备苯丙酮尿症模型猪;(c)制备苯丙酮尿症细胞模型或苯丙酮尿症组织模型或苯丙酮尿症器官模型。4.PAH
‑
gRNA1、PAH
‑
gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用;PAH
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gRNA1为权利要求1中所述的PAH
‑
gRNA1;PAH
‑
gRNA4为权利要求1中所述的PAH
‑
gRNA4;NCN蛋白为权利要求1中所述的NCN蛋白;所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c):(a)制备重组细胞;(b)制备苯丙酮尿症模型猪;(c)制备苯丙酮尿症细胞模型或苯丙酮尿症组织模型或苯丙酮尿症器官模型。5.PAH
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gRNA1、PAH
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gRNA4和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用;PAH
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gRNA1为权利...
【专利技术属性】
技术研发人员:牛冬,汪滔,马翔,王磊,程锐,曾为俊,赵泽英,方园,
申请(专利权)人:南京启真基因工程有限公司,
类型:发明
国别省市:
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