针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒，试剂盒包括：由Xaa

【技术实现步骤摘要】
针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及微生物耐药性检测领域，具体涉及一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]近年来，由于抗生素在畜牧业、工业等领域大量无指征使用以及新的抗菌药物不断进入临床治疗感染性疾病，导致细菌的耐药性正以惊人的速度在增长，甚至已出现超级细菌和多重耐药菌。自20世纪20年代开始，大量天然抗生素相继被发现，开启了抗生素时代，但随着对抗生素使用的过度依赖，细菌抗药问题日益凸显。耐药性细菌使得抗生素药物效减弱、甚至失效。多粘菌素(Polymyxins)是多粘杆菌培养液中提得的一组多肽类抗生素，有5种成分(A,B,C,D,E)。临床常用的是多粘菌素(PolymyxinB)和多粘菌素E(colislin,抗敌素)。多粘菌素被认为是人类抗击细菌的最后防线；近几年来，质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr的快速进化及其在全球范围内的广泛传播，给公共卫生和人类健康造成了严重威胁，由于MCR
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3的广泛存在，特别是在健康人群和动物性食品中的存在，使得现用的基于MCR基因的选筛菌、菌种鉴定、药敏检测和普通PCR验证的检测程序方法变得十分繁琐且低效，需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。
[0003]目前关于多粘菌素耐药的检测技术主要涉及基于PCR法的各种耐药基因的核酸扩增法(聚合酶链式反应和Taqman探针荧光PCR,等温扩增LAMP)，但这些检测方法只能检测各种样本中是否存在耐药基因MCR，而且需要PCR仪这样的专用仪器，在普通环境及家庭环境中，并不能完全满足快检的需要(随时随地，低成本，速度快，时间短)。例如多个实验室应用的RT
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qPCR是一种具有较高使用难度的单一性检测手段，且难以检测未知的抗性基因，如HT
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qPCR检测前需要设计引物，无法提供宿主信息，一旦引物(复合PCR)对之间形成的二聚体有可能会干扰实验结果，降低检测的灵敏度，不同的PCR(微滴数字PCR)检测通量有限，需要设计引物。
[0004]夹芯ELISA免疫分析(Sandwich ELISA enzyme linked immunosorbent assay immunoassay)是利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的抗原(产生多粘菌素耐药性的受检菌细胞壁组份脂多糖LPS的真核细胞受体的短链式多肽模拟物)—受检菌—抗体(生物素标记的较长的LPS的受体多肽模拟物)的免疫测定技术。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术。间接ELISA免疫分析法的原理是免疫反应中的酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接的标记上酶，加入底物后反应的颜色深浅代表待测耐药性阳性菌的量。具有灵敏度高，操作简便、快速、易标准化的特点。目前市面上只存在检测多粘菌素耐药基因MCR的核酸检测方法的试剂，且制备样品需要较长的时间和较高的纯度，无法与本方法的对样品纯度要求低，数量要求少，仪器要求少，成本低，省时相提并论。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒。
[0006]1、小肽的设计：
[0007]筛选分析大肠杆菌细胞壁中脂多糖LPS的受体复合物(先分别依次分析TRL4，CD14，LBP的氨基酸序列，然后再取三者作用力的交集)序列及空间结构获得其模体序列：XSS/FS/FISSXRAC，对其进行分析后设计出能识别LPS的肽段，送去商业化学公司根据合成的难易程度及稳定性评估与初试后，并将肽段优化为的9，13个氨基酸的小肽，其中9肽为XFSISSXRA，13肽为KNYSSSIFFIHAC，使其适用于制作成检测大肠杆菌菌体的抗原或抗体(包括同时设生物素标记的N端与C端)。
[0008]2、本专利技术的目的是针对现有检测多粘菌素耐药的方法及试剂盒，需要制备高纯度的样品(另外的试剂盒)及中型PCR仪等专用仪器，成本高，无法便携，需要经培训的专业人员操作，检测效率和检测速度无法满足要求的缺陷和不足，提供一种结构合理，使用方便，能够实现对多粘菌素耐药性的鉴别，敏感性和特异性好，便于实现高通量检测，检测效率和检测速度得到了极大提高的一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒。
[0009]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术解决方案是：
[0010]一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，包括：
[0011]由Xaa
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Phe
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Ser
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Ile
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Ser
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Ser
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Xaa
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Arg
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Ala(SEQ ID NO.1，为XFSISSXRA)所示的氨基酸序列组成的9肽作为抗原；
[0012]由Lys
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Asn
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Tyr
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Ser
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Ser
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Ser
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Ile
‑
Phe
‑
Phe
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Ile
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His
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Ala
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Cys(SEQ ID NO.2，KNYSSSIFFIHAC)所示的氨基酸序列组成的13肽作为一抗。
[0013]还包括：包被板、样品稀释液、酶结合物、显色液A、显色液B。
[0014]还包括：浓缩洗涤液、终止液和用于血清稀释的血清稀释板。
[0015]9肽抗原包被在所述包被板上的孔内。
[0016]所述的样品稀释液包括：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾和水。
[0017]所述的酶结合物为链霉亲和素。
[0018]所述显色液A为pH 2.5～3.5的乙酸钠水溶液，其中包含柠檬酸、过氧化氢、乙酸钠；
[0019]所述显色液B为pH 2.5～3.5的TMB水溶液，其中包含TMB、柠檬酸、EDTA
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Na2、甘油。
[0020]一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法，利用化学合成的9肽对包被板进行包被，加入待检菌，13肽进行生物素标记作为一抗加入，链霉亲和素作为二抗加入，利用13肽与链霉亲和素的高度特异性结合的特性，加入显色液A和显色液B，进行检测。
[0021]具体的本专利技术技术方案：
[0022](1)根据脂多糖LPS的受体的氨基酸序列设计出一种长度不等的两种小肽(9肽，13肽)，通过生物合成的方法做成相应的抗原(9肽)，用于包被ELISA板，用生物素标记13肽用于ELISA法中的一抗；(2)一种用于检测多粘菌素耐药大肠杆菌的夹芯式间接ELISA法检测试剂盒，包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、终止液，所述包被板上包被两种小肽抗原，9肽蛋白抗原包被在所述被板上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：由Xaa
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Phe
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Ser
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Ile
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Ser
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Ser
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Xaa
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Arg
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Ala所示的氨基酸序列组成的9肽作为抗原；由Lys
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Asn
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Tyr
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Ser
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Ser
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Ser
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Ile
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Phe
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Phe
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Ile
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His
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Ala
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Cys所示的氨基酸序列组成的13肽作为一抗。2.根据权利要求1所述的针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：包被板、样品稀释液、酶结合物、显色液A、显色液B。3.根据权利要求2所述的针...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘月环，柯舒文，段悦庆，王成豪，王玉莹，吴旧生，杨华，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：