一种经鼻给药靶向神经元的转运载体、其改造方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种经鼻给药靶向神经元的转运载体，该所述转运载体为带有RVG

【技术实现步骤摘要】
一种经鼻给药靶向神经元的转运载体、其改造方法及应用


[0001]本专利技术涉及神经退行性疾病治疗领域，具体涉及一种经鼻给药靶向神经元的转运载体、其改造方法及应用。

技术介绍

[0002]神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)是以发作迟缓和选择性神经元的功能障碍为特征表现，由于大脑和脊髓的神经元细胞丧失而引起的一类不可逆转的神经系统疾病,主要包括阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)、帕金森氏病(Parkinson
’
s disease,PD)和亨廷顿氏病(Huntington
’
s disease,HD)等。这些疾病临床表现均为认知功能下降,虽然其具有不同的组织病理学特征,但可能具有共同的细胞和分子机制。开发靶向受损神经元的治疗方式，成为治疗神经退行性疾病有效的手段，对提高老年人的生命质量和寿命具有重要的理论和实际意义。
[0003]尽管已经开发出能够优先靶向受损神经元细胞而不伤害正常组织的药物，但由于难以穿透血脑屏障，将这些药物运送到大脑仍然是一个重大挑战且由于难以在大脑中维持有效的药物剂量，许多治疗药物的进一步开发受到阻碍。此外，利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)等可以在基因水平上抑制神经退行性疾病理性损伤蛋白的异常表达，然而由于非编码RNA在体循环中易于降解以及缺乏合适的传输提呈系统，以RNA干扰为基础的临床治疗受到阻碍。
[0004]在针对神经退行性疾病的外泌体治疗方法中，使用外泌体作为转运载体是一个最新的发展。外泌体具有在细胞间穿梭的能力，具有成为治疗多种疾病工具的潜能，但是缺乏靶向性，其临床应用受到一定阻碍。

技术实现思路

[0005]针对上述存在的技术不足，本专利技术的目的是提供一种经鼻给药靶向神经元的转运载体、其工程化改造方法及应用，对神经元的靶向性好，选择性高，低毒性、低免疫原性和高可工程性，并通过鼻腔给药后有效地将内含物转导到中枢神经系统，提高药物穿脑效率，降低治疗所需的药物浓度。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术人为了解决上述问题进行了深入研究，研究发现通过工程化技术使外泌体表面表达某些分子，可使外泌体具有组织特异性趋向，装载各种分子(药物或siRNA)后可靶向特定组织/器官。其中，改良的狂犬病毒糖蛋白(RVG)配体本身与神经特异性乙酰胆碱受体相互作用，带有RVG
‑
Lamp2b的工程化外泌体能使siRNA或者药物转运到神经元细胞质内，治疗疾病。
[0008]通过配受体之间的相互作用，我们发现RVG
‑
Lamp2b工程化外泌体也可以在鼻腔给药后有效地将内含物转导到中枢神经系统，避免了内容物受体内核酶以及氧化还原酶的影响，并提高药物穿脑效率，降低治疗所需的药物浓度。目前，利用外泌体治疗神经疾病的给
药方法绝大部分为普通静脉注射，但是，鼻腔内给药普遍认为到达脑部的距离更短；此外，鼻腔给药是一种非侵入式的、允许重复给药、患者接受度较高的方法。
[0009]具体技术方案如下：一种经鼻给药靶向神经元的转运载体，所述转运载体为带有RVG
‑
Lamp2b的工程化改造的外泌体，负载药物分子后，经鼻给药后靶向受损神经元。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供一种经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞，所述分泌细胞由质粒转染细胞中制成，该质粒碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含人源的Lamp2b蛋白和细胞外域部分RVG蛋白，在RVG
‑
Lamp2b重组蛋白的羧基末端区域添加了HA标签并带有氨苄青霉素抗性基因。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供一种上述分泌细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0012]S1:转染前，细胞接种于含10％FBS的DMEM
‑
高糖培养基；
[0013]S2:转染时，细胞汇合度为50
‑
60％，吸去旧的培养基，用PBS洗涤，然后加入13
‑
17ml无双抗无血清的培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中；
[0014]S3:在离心管中分别加入无双抗无血清的DMEM和质粒轻柔混合制成DNA稀释液，其体积质量比为1：15～20(ml/ug),室温下静置；
[0015]S4:在另一个离心管里分别加入无双抗无血清的DMEM和Reliable Transfectin Reagent,轻柔混匀，制成Reliable Transfectin Reagent稀释液，其体积比为20～25:1室温下静置；
[0016]S5:复合步骤S3和步骤S4中的稀释液，制成DNA
‑
Reliable Transfectin Reagent复合物，室温下静置；
[0017]S6:培养皿中加入DNA
‑
Reliable Transfectin Reagent复合物，晃动培养皿稍加混匀；
[0018]S7:在5％CO2、37℃培养箱中孵育4～6h用新鲜的完全培养基替换含有转染复合物的培养基，形成产生目标外泌体的分泌细胞。
[0019]进一步地，所述分泌细胞中外泌体的提取方法，包括以下步骤：
[0020]S1:收集细胞培养液，于4℃下300g离心10～15min除去培养液中残留的细胞，3000g离心10～15min除去培养液中残留的死细胞，10000g离心30～40min除去培养液中的细胞碎片；
[0021]S2:将上述步骤S1收集的培养液进行超速冷冻离心，4℃下160000～170000g离心60～70min，弃去上清，用预冷的PBS重悬贴壁沉淀即可获得外泌体。
[0022]进一步地，将步骤S2获得的外泌体过0.22um的滤头获得纯度更高且分散的外泌体；多个离心柱沉淀合管，重新离心后外泌体浓度提高。
[0023]本专利技术的第四个目的是提供一种经鼻给药靶向神经元的转运载体在制备神经退行性疾病诊断、治疗和预测药物中的应用。
[0024]本专利技术的第四个目的是提供一种经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞在制备神经退行性诊断、治疗和预测药物中的应用。
[0025]本专利技术的有益效果在于：
[0026]1.靶向性好，选择性高。对外泌体表面分子的靶向修饰改造赋予其细胞和组织特异性，利用工程化改造的外泌体向神经元细胞递送药物分子；本专利技术提供的外泌体相比一
般外泌体靶向性好，与神经组织内细胞的融合情况好，且本专利技术的外泌体对神经元有特异性，对脑组织中其他小胶质细胞和星形胶质细胞没有特异性；
[0027]2.本专利技术通过工程化外泌体介导的药物递送具有低毒性、低免疫原性和高可工程性，并有望用于多种疾病的无细胞疗法；
[0028]3.本专利技术工程化外泌体在鼻腔给药后有效地将内含物转导到中枢神经系统，避免了内容物受体内核酶以及氧化还原酶的影响本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种经鼻给药靶向神经元的转运载体，其特征在于，所述转运载体为带有RVG
‑
Lamp2b的工程化改造的外泌体，外泌体具有组织特异性趋向，装载药物分子后，经鼻给药后靶向受损神经元。2.一种权利要求1所述的经鼻给药靶向神经元的转运载体的分泌细胞，其特征在于，所述分泌细胞由质粒转染细胞中制成，该质粒碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示，包含人源的Lamp2b蛋白和细胞外域部分RVG蛋白，在RVG
‑
Lamp2b重组蛋白的羧基末端区域添加了HA标签并带有氨苄青霉素抗性基因。3.一种权利要求2所述的分泌细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1:转染前，细胞接种于含10％FBS的DMEM
‑
高糖培养基；S2:转染时，细胞汇合度为50
‑
60％，吸去旧的培养基，用PBS洗涤，然后加入13
‑
17ml无双抗无血清的培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中；S3:在离心管中分别加入无双抗无血清的DMEM和质粒轻柔混合制成DNA稀释液，其体积质量比为1：15～20(ml/ug),室温下静置；S4:在另一个离心管里分别加入无双抗无血清的DMEM和Reliable Transfectin Reagent，轻柔混匀，制成Reliable Transfectin Reagent稀释液，其体积比为20～25:1室温下静置...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛海晨，薛森林，闫微，周徐，李海英，宋远见，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：